[发明专利]一种荧光量子点标记的壳聚糖DNA纳米复合载体及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于应用纳米生物技术领域，涉及一种荧光量子点标记的壳聚糖DNA纳米复合载体及其制备方法，以及应用于麻疯树基因转导的方法。

背景技术

纳米载体在介导基因转移方面具有一定的优势：生物安全性好，可生物降解，毒性和免疫原性小；保护基因不受各种补体及酶的破坏；具有特殊结构及表面电荷；在其表面能偶联特异性靶向分子。国内外不少专家和学者尝试利用纳米材料作为载体进行动物细胞外源基因转化及基因治疗，取得了可喜的进展。最近也有科学家利用纳米载体进行植物基因转化的探索性研究。美国爱荷华州立大学的植物学家与化学家成功地利用中孔洞纳米粒为载体，将基因及刺激该基因表达的化合物，穿过植物细胞壁，在细胞中适当地点释放。这项突破除了将纳米科技带入植物生物学的领域，也对植物基因转化提供更有利的工具。目前研究人员已经成功的将基因及化合物转入拟南芥、烟草以及玉米等植物中。国内对植物转基因的研究才刚刚起步，湖南大学刘俊等制备了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒，在超声波介导下，将绿色荧光蛋白基因导入盾叶薯蓣细胞中，有效突破了植物细胞壁的天然屏障，首次实现了该方法对转基因的活体、实时检测。

要用这种纳米颗粒基因载体将外源基因导入植物受体细胞时，存在以下方面的挑战：基因-纳米颗粒复合物与细胞进行共培养时，细胞壁的屏障使外源基因整合到细胞基因组的中间环节多，使大部分携带DNA的纳米颗粒难以直接进入细胞，难以直接携DNA扩散到细胞核膜上，并穿过核膜孔或在细胞分裂过程中进入细胞核以表达外源基因。利用荧光化合物对植物基因载体转导过程进行实时追踪是纳米载体研究向前迈进的一个重要方向。目前对荧光化合物标记载体进行基因转导研究的报道还很少。而与传统的有机荧光染料相比，纳米量子点具有独特的光学特性和应用前景：发出不同颜色荧光，可分辨或标记不同的目标物，实现单分子、多目标检测；光化学稳定性高，不易发生光漂白，可长时间连续跟踪成像；发光寿命长，适合谱带多元化和时间序列化的生物检测等优点。

发明内容

本发明的目的之一是利用量子点优异的荧光性能，提供一种壳聚糖DNA荧光纳米复合载体及其制备方法，这种方法不需要苛刻的设备条件，操作简便，原料安全易得，价格低廉。

本发明的目的之二是提供上述这种壳聚糖DNA荧光纳米复合载体在植物转基因的应方法，特别是用于麻疯树基因转导的方法。

为达到以上目的，本发明的技术方案为：

一种荧光量子点标记的壳聚糖DNA纳米复合载体是以壳聚糖与DNA载体的结合物为中心，周围包覆荧光量子点的复合物；所述的荧光量子点包括CdSe、CdS或ZnSe量子点；以及其它II～VI族或III～V族元素组成的化合物。

一种荧光量子点标记的壳聚糖DNA纳米复合载体的制备方法是先将壳聚糖和DNA载体制备成壳聚糖DNA载体，再加入CdSe、CdS或ZnSe量子点混匀，过滤即可。具体过程如下：

将等体积的壳聚糖和溶于5mM硫酸钠中的DNA溶液分别在55℃预热30分钟，旋涡混匀仪混合30秒，形成壳聚糖DNA载体；加入CdSe量子点(100uL，0.5mM)到载体溶液中，旋涡混匀2分钟，超滤分离除去未反应的量子点，并用0.22um微孔滤膜的过滤灭菌器进行过滤，得到复合载体。

所述的壳聚糖的分子量范围为10-30万，在pH为5.5的5mM醋酸钠溶液中完全溶解，浓度为200ug/mL；所述的溶于5mM硫酸钠中的DNA溶液浓度为80ug/mL。

所述的CdSe量子点的制备方法：是以L-半胱氨酸(1.5mM)为稳定剂在水相中合成，水浴温度30℃，水浴时间90min，L-Cys∶Cd∶Se为(摩尔比3∶2∶1)，pH值为8。

所述的DNA载体为pEGAD质粒或pBI121质粒，金维克(中国)生物技术中心购买。

上述制备得到的荧光量子点标记的壳聚糖DNA纳米复合载体能应用于植物转基因；特别是能应用于麻疯树转基因。具体过程如下：

将麻疯树愈伤组织在30mL新鲜培养基中培养一个星期；然后所述的复合载体加入到1mL的含松散愈伤组织的受体溶液，超声波处理6分钟(超声功率200W)，经过2天共培养，完成转导。

本发明的优势：

1、本发明首次将荧光量子点与壳聚糖DNA结合，制备出一种复合载体，该方法不需要苛刻的设备条件，操作简便，原料安全易得，价格低廉；