[发明专利]二甲基精氨酸二甲胺水解酶测定方法及其诊断试剂

说明书

技术领域：

本发明涉及二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase EC3.5.3.18，DDAH)活力的酶学循环测定方法及其诊断试剂，属于医学检验测定技术领域。

背景技术：

非对称二甲基精氨酸是一种甲基化精氨酸，是内源性一氧化氮合酶(Nitric oxide sythase，NOS)抑制剂，可竞争性抑制一氧化氮(Nitric oxide，NO)的合成。它是细胞内蛋白质在精氨酸甲基转移酶作用下发生甲基化，再经水解反应生成的非对称二甲基精氨酸。二甲基精氨酸二甲胺水解酶通过调节体内非对称二甲基精氨酸的水平而影响NOS的活性，进而调节体内NO的生成。DDAH活性与多种心血管疾病之间存在密切关系，被认为是新的心血管疾病相关蛋白和药物防治靶点。

DDAH是胞内酶，有DDAH1和DDAH2两个亚型，与胚胎组织比较，出生后组织中DDAH2表达显著增加，而DDAH1表达基本无变化。这两种亚型在体内分布存在差异，其中DDAH1多存在于主要表达神经型NOS的组织，如大脑和肾脏等；而DDAH2则多存在于以内皮型NOS表达为主的组织，如心脏、血管和肾脏等。

临床应用中对二甲基精氨酸二甲胺水解酶的测定方法主要包括：高压液相色谱法、酶联免疫法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器、操作复杂，试验耗时较长，不能应用于临床大流量的自动化分析，并且价格昂贵。

Y-L Tain和C Baylis在Kidney Int.2007 October；72(7)：886-889中报道了一种测定大鼠肾脏组织样本中DDAH的改良方法，该方法采用手工法测定生成的L-瓜氨酸，灵敏度低，不能自动化。

由于DDAH在组织样本中的含量很低，常规临床酶学的测定方法无法达到所需的测定灵敏度，限制了常规方法的采用。在酶学方法测定DDAH技术方面，虽然近年来酶学检测的信号增量技术不断发展，但至今未见有关酶循环法测定DDAH活力的方法学报道；也未见DDAH全自动诊断试剂的报道和应用。

本发明公开了一种新的测定组织样本中DDAH的酶循环方法，该方法不受样本中干扰物质的干扰，具有优良的反应灵敏度。首次提出并建立了采用酶学循环方法测定组织样本中DDAH方法学新原理及其应用试剂。该试剂可应用于目前各类广泛使用的临床自动分析仪，从而达到快速、大规模测定样本的要求。

发明内容：

本发明提供了一种采用循环增量技术的酶学测定方法及其试剂，测定组织样本中DDAH的活力。其设计原理是：样本中的DDAH催化非对称二甲基精氨酸水解为二甲胺和L-瓜氨酸(L-Citrulline)，产物L-瓜氨酸在瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC 3.5.1.20)的作用下，水解为L-鸟氨酸(L-Ornithine)、二氧化碳和氨；生成的L-鸟氨酸与试剂中的氨基甲酰磷酸盐在鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2.1.3.3)的作用下，再生成L-瓜氨酸和磷酸盐。在该酶循环反应系统中，L-瓜氨酸的生成量与样本中DDAH的活力成正比，通过测定酶循环反应体系中氨的生成速率，就可以达到测定样本中DDAH活力的目的。

临床应用中酶法测定氨浓度的方法很多，最常见的是谷氨酸脱氢酶反应方法。氨与a-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下，产生L-谷氨酸，同时辅酶NADH或NADPH被氧化为NAD⁺或NADP⁺，反应系统在340nm处的吸光度值下降。可通过测定该吸光度的下降值计算出氨的浓度，从而得出被测酶的活力。

由于本发明设计的酶循环方法中的L-瓜氨酸反复循环参与反应，不断产生氨，故大大提高了测定的灵敏度。

本发明关于DDAH活力测定的酶循环法测定方法学原理如下：

非对称二甲基精氨酸+水二甲基精氨酸二甲胺水解酶L-瓜氨酸+二甲胺

L-瓜氨酸+水瓜氨酸水解酶L-鸟氨酸+二氧化碳+氨

L-鸟氨酸+氨基甲酰磷酸盐鸟氨酸氨甲酰转移酶L-瓜氨酸+磷酸盐