[发明专利]二甲基精氨酸二甲胺水解酶测定方法及其诊断试剂

权利要求书

1.一种对组织样本中二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolaseEC 3.5.3.18，DDAH)活力的测定方法，其方法学设计特征在于：样本中的二甲基精氨酸二甲胺水解酶催化底物非对称二甲基精氨酸水解为二甲胺和L-瓜氨酸(L-Citrulline)，产物L-瓜氨酸在瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC 3.5.1.20)的作用下，水解为L-鸟氨酸、二氧化碳和氨；在这一新的产品检测方法中，使生成的L-鸟氨酸与试剂中的氨基甲酰磷酸盐在鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2.1.3.3)的催化作用下，再生成L-瓜氨酸和磷酸盐。在其中的酶循环反应系统中，L-瓜氨酸的生成量与样本中DDAH的活力成正比，氨的生成速率与L-瓜氨酸的生成速率成正比，通过测定氨的生成速率可以计算出样本中被测物的浓度。其酶学方法学原理如下：

非对称二甲基精氨酸+水二甲基精氨酸二甲胺水解酶L-瓜氨酸+二甲胺

L-瓜氨酸+水瓜氨酸水解酶L-鸟氨酸+二氧化碳+氨

L-鸟氨酸+氨基甲酰磷酸盐鸟氨酸氨甲酰转移酶L-瓜氨酸+磷酸盐

2.一种二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力的测定试剂，根据权利要求1所述的方法学原理，氨在谷氨酸脱氢酶的催化作用下，与a-酮戊二酸反应，生成L-谷氨酸，同时还原型辅酶被氧化为氧化型辅酶，反应系统在辅酶特定波长处的吸光度值下降。通过测定该吸光度的下降值可计算出氨的浓度，从而达到测定样本中二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力的目的。

氨+a-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶L-谷氨酸+氧化型辅酶

其主要成分包括：

其特征在于：试剂可以是干粉或冻干试剂，使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力测定试剂，其中酶包括瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC 3.5.1.20)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2.1.3.3)和谷氨酸脱氢酶；还原型辅酶是指还原型辅酶I(NADH)、还原型辅酶II(NADPH)或还原型硫代辅酶I(thio-NADH)中的一种，底物是指非对称二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸盐和a-酮戊二酸。

4.根据权利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力测定试剂，其特征在于：由缓冲液、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶、非对称二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸盐、a-酮戊二酸和稳定剂组成的单试剂。

5.根据权利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力测定试剂，其特征在于：由缓冲液、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶、非对称二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸盐、a-酮戊二酸和稳定剂组成的双试剂试剂。试剂1，由缓冲液、还原型辅酶、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶和稳定剂组成，试剂2，由缓冲液、非对称二甲基精氨酸、谷氨酸脱氢酶、氨基甲酰磷酸盐、a-酮戊二酸和稳定剂组成。瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶、非对称二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸盐、a-酮戊二酸在试剂1或在试剂2的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力测定试剂，其特征在于：由缓冲液、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶、非对称二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸盐、a-酮戊二酸和稳定剂组成的多试剂试剂。试剂1，由缓冲液、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶、a-酮戊二酸和稳定剂组成，试剂2，由缓冲液、氨基甲酰磷酸盐和稳定剂组成；试剂3，由缓冲液、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、非对称二甲基精氨酸和稳定剂组成。瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶、非对称二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸盐、a-酮戊二酸在试剂1或在试剂2或在试剂3的位置可以不限。

7.根据权利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力测定试剂，其特征在于：还包括稳定剂0.1～3000mmol/L或0.1～100％体积比。所述稳定剂为：甘露糖醇(Mannitol)，甘油(Glycerol)，聚乙二醇(PEG)，牛血清白蛋白、EDTA，钠离子，钾离子，氯离子、锌离子，表面活性剂及防腐剂中的至少一种。