[发明专利]检测RNA分子的方法、试剂盒及其相关用途

说明书

技术领域

第一方面，本发明涉及检测RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：提供含有所述RNA分子的样品；将第一多核苷酸与所述RNA分子杂交；延伸所述第一多核苷酸以产生第一链cDNA；将第二多核苷酸与所述第一链cDNA杂交，其特征在于所述第二多核苷酸是3′-不可延伸的寡核苷酸；延伸所述第一链cDNA以产生延伸反应产物；通过聚合酶链式反应扩增所述延伸反应产物；以及通过实时荧光读出（real-time fluorescence readout）检测扩增产物。另一方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含如本发明所定义的第一和第二多核苷酸、一组dNTPs、逆转录酶和检测部分。还另一方面，本发明涉及根据本发明的所述试剂盒用于检测RNA分子的用途。

背景技术

RNA分子在多种生物的基因表达中发挥重要作用。最近，发现小RNAs是转录后基因表达，特别是基因沉默的重要调节子，对活细胞中的生理和病理过程有影响。由小RNAs引导的基因沉默过程首先于1993年在线虫类（nematode）秀丽新杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现。在其中，显示lin-4 基因的21-nts长的非编码RNA 转录物介导称为lin-41的靶基因的抑制。这种抑制显示为依赖于短lin-4 RNA分子和源自lin-41基因的mRNA转录物的3′-非翻译区(UTR)之间的互补碱基配对。从那时起，已发现短RNAs是植物、动物和DNA病毒中一类丰富的基因调节子，已在从裂殖酵母到人类的多种生物中鉴定了不同来源和功能的短RNAs。短调节RNAs的种类包含例如miRNA(微RNA)、siRNA(小干扰RNA)、piRNA (Piwi-相互作用RNA)以及rasiRNA (重复相关小干扰RNA)。在它们之中，miRNAs是植物和动物中最丰富类型的小调节RNAs。例如，大约3 %的人类基因编码miRNAs，最多30 %的人类蛋白编码基因被认为由miRNAs调节。迄今，通过克隆和测序已鉴定出大于10.000种不同的miRNAs(参见，例如，miRBase: the microRNA registry database at http://www.mirbase.org/，Sanger Institute，UK)。一般而言，miRNAs的特征为21-25个核苷酸(nts)的长度并由长度大约为70个核苷酸的较长内源发夹转录物（称为前体-miRNAs或pre-miRNAs）加工而来。对于lin-4 RNA的情况，已显示miRNAs通过在miRNA和它的靶mRNA之间形成互补碱基对的机制来调节蛋白表达。该过程引起蛋白翻译的抑制，并且，根据miRNA与它的靶位点之间序列互补的程度，引起mRNA转录物的降解 (综述参见，例如，Bartel，2009)。

改变的miRNA表达已显示出导致人类疾病，特别是癌症，这是基于与正常组织相比，恶性肿瘤和肿瘤细胞系显示失调的miRNA表达概况的发现(综述参见，例如，Sassen等人，2008)。即，在人类癌症中已观察到miRNA水平的总体降低，这表明小调节RNAs可能在肿瘤抑制中具有内在功能。Lu等人 (2005)通过在334种人类癌症、癌症细胞系和正常组织中分析总计217种人类和小鼠miRNAs，首次显示：与相应正常组织相比，许多miRNAs的表达水平在癌症中显著降低。这些作者发现癌症伴随显著降低的总体miRNA表达，并且与分化较高的肿瘤相比，分化较差的肿瘤显示较低miRNA水平。另一项最近的研究检测了241种人类miRNAs在人类癌症细胞系的综合组（comprehensive panel）、NCI-60组，和正常组织中的表达，并且证实了与相应正常组织相比，大部分miRNAs在源自人类肿瘤的细胞系中以较低水平表达的发现 (Gaur等人，2007)。