[发明专利]检测RNA分子的方法、试剂盒及其相关用途

权利要求书

1.检测RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 提供含有所述RNA分子的样品；

b) 将包含第一引物结合位点的第一多核苷酸与所述RNA分子杂交；

c) 通过逆转录所述RNA分子的序列延伸所述第一多核苷酸以产生第一链cDNA；

d) 将第二多核苷酸与所述第一链cDNA杂交，其中所述第二多核苷酸是3′-不可延伸的寡核苷酸，其包含

(i) 3′-部分，其与所述第一链cDNA的一部分互补，以及

(ii) 5′-突出端，其包含第二引物结合位点的序列；

并且其中所述第二多核苷酸包含至少一个或几个dU核苷酸残基；

e) 在不存在dUTP的情况下，延伸所述第一链cDNA以产生延伸反应产物，所述延伸反应产物包含与所述第二引物结合位点互补的序列；以及通过优选不耐热的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)的酶促反应消化所述第二多核苷酸；

f) 在检测部分存在的情况下，使用与所述第一引物结合位点互补的第一引物和与所述第二引物结合位点互补的第二引物，通过聚合酶链式反应扩增所述延伸反应产物；以及

g) 通过实时荧光读出而检测所述扩增产物。

2.权利要求1的方法，其特征在于所述RNA分子具有15-200个核苷酸，优选20-100个核苷酸的长度。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述RNA分子选自成熟miRNA(miRNA)、前体miRNA(pre-miRNA)、初级miRNA前体(pri-miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piRNA(piwi-相互作用RNA)、前体piRNA和短发夹RNA(shRNA)。

4.权利要求1至3任一项的方法，其特征在于步骤a)的所述RNA分子在3′-末端通过多核苷酸尾延伸，该延伸优选通过聚腺苷酸聚合酶、末端转移酶或连接酶的酶促反应，更优选通过聚腺苷酸聚合酶的酶促反应来进行。

5.权利要求1至4任一项的方法，其特征在于所述第一多核苷酸与所述RNA分子的序列互补、与所述多核苷酸尾互补，或与二者均互补。

6.权利要求1至5任一项的方法，其特征在于所述第二多核苷酸具有3′-末端磷酸形式的封闭的3′-末端。

7.权利要求1至6任一项的方法，其特征在于步骤f)中的所述检测部分是嵌入染料。

8.权利要求1至7任一项的方法，其特征在于步骤f)中的所述检测部分是水解探针。

9.权利要求8的方法，其特征在于在步骤f)中扩增至少两种不同的延伸反应产物。

10.权利要求9的方法，其特征在于所述步骤f)中的扩增在至少两种水解探针存在的情况下进行，其中至少一种所述水解探针对特定种类的RNA分子具有特异性，并且其中所述探针包含不同组的供体/受体部分。

11.权利要求10的方法，其特征在于所述特定种类的RNA分子源自一种前体分子，优选地所述特定种类的RNA分子具有不同长度。

12.权利要求9至11任一项的方法，其特征在于不同种类的RNA分子之间的比例通过不同扩增产物的检测，优选地通过具有可区分的荧光读出的不同扩增产物的检测来确定。

13.试剂盒，包含:

如前述权利要求任一项所定义的第一和第二多核苷酸，

一组dNTPs，

逆转录酶，以及

检测部分，优选对一种或多种不同RNA分子具有特异性的一种或多种水解探针，

具有尿嘧啶-DNA-糖基化酶 (UNG) 活性的酶，

以及任选地如前述权利要求任一项所定义的第一和/或第二引物。

14.根据权利要求13的试剂盒用于检测RNA分子，优选用于检测如权利要求2-3任一项所定义的一种或多种RNA分子的用途。