[发明专利]一种微生物及其分离、培养方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种微生物及其分离、培养方法与应用。

背景技术

据联合国粮农组织调查资料介绍，全球每年被病虫害夺去的谷物占收成的20％-30％，由此造成的经济损失达1200亿美元。世界各国为了对付日益复杂的病虫害，每年要生产各种化学农药200多万吨，这些化学农药相当一部分是高毒高残留，毫无疑问生物农药的崛起成为现代农药的发展趋势。我国是一个农业大国，每年由农作物病虫害造成的经济损失巨大。而且，由于化学农药的滥用，人畜中毒事件频频发生，生态环境遭到了严重破坏，环境污染日趋严重；另一方面日本、欧盟等国相继提高了农残限制标准，对于我国农产品的出口提出了更高的要求。因此利用现代生物技术研究高效低毒的生物农药，控制农作物的病虫害、降低农残对我国有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对目前尚无有效地拮抗性微生物用于防治鳞翅目昆虫病害，而提供一种从土壤中筛选培养出特定的拮抗性微生物来防治昆虫病害，本发明还提供了该微生物的分离、培养方法与应用。

昆虫病害的生物防治，就是利用拮抗性微生物来防治昆虫的病害。为了有效地分离筛选到能对上述各种鳞翅目昆虫病害有抑制作用的生防菌株，本发明采取了平板透明圈法和DNS比色法筛选到链霉菌Streptomyces sp.A0901，该菌种已于2010年11月25日在中国专利局指定的保藏单位(中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101)保藏，其保藏登记号为CGMCC NO 4367。

本发明的微生物A0901菌株具有下述性质：

菌体形态特征：

在固体高氏一号培养基(配方：可溶性淀粉2g，KNO₃ 0.1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.001g，琼脂1.8g，H₂O 100ml，pH 7.2～7.5，下同)上29℃培养2天，菌落扩散生长，表面光滑，菌落边缘产孢区常排成同心螺纹，产孢区最初成白色，逐渐变成灰白色，继而呈现灰褐色；4天后形成局限突起的灰褐色菌落团，菌落背面高氏一号培养物暗黑色，老的培养基散发一股土腥气。

其基丝弯曲幅度较大，发达，气丝少弯曲，孢子链无螺旋，分支较短。

16S rDNA基因序列

用27f与1492r为引物进行扩增出该菌株的16S rDNA基因的部分序列，测序结果在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与链霉菌的相似性最高，达到99％。

本发明微生物的培养方法是：

先采用固体高氏一号培养基，将上述菌在试管斜面培养基上接种后，28-30℃下活化培养，两天后，再采用液体高氏一号培养基，将试管中链霉菌接种在锥形瓶高氏一号液体培养基中29℃恒温生化培养箱中培养48h。

上述微生物的液体发酵制备方法按以下步骤进行：

1)试管培养基：采用灭菌固体高氏一号培养基，将A0901菌接种在试管培养基上，28-30℃下培养44-48h；

2)扩大培养基：采用灭菌液体高氏一号培养基，将试管培养基中A0901菌接种在锥形瓶中，置于摇床上28-30℃下培养58-65h小时作为种子液；

3)液体发酵培养基：采用液体高氏一号培养液，121℃高压灭菌20min左右，待灭菌培养液冷却至29℃时，将锥形瓶中的培养物按6-8％(v/v)的比例接入发酵液，29℃下培养120h小时得到相应拮抗菌的菌浆。

该微生物的分离方法是：在99ml无菌水中加入1g土样(土样取自合肥丰乐园西瓜田地)制备土壤稀释液，在高氏一号培养基内加入50mg/ml制霉素溶液(100ml加入100μl)，倒入培养皿中，静置冷却成平板。采用稀释涂布法将稀释后的土壤溶液分别涂布于平板上，然后倒置于29℃恒温生化培养箱中培养，待菌长出后，用接种针在另一灭菌固体高氏一号培养基上进行划线分离，经纯化培养后得到放线菌菌株。