[发明专利]一种驽巴贝斯虫病免疫印迹检测方法及试剂盒制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种驽巴贝斯虫病免疫印迹检测方法及试剂盒制备方法，特别涉及一种使用免疫印迹试验检测驽巴贝斯虫病（Babesia caballi）血清抗体的方法及其诊断试剂盒的制备方法，属于马属动物血液原虫病检测领域。

背景技术

驽巴贝斯虫病(Babesia caballi)是由驽巴贝斯虫寄生于马属动物的红细胞内所引起的血液原虫病，临床表现为高热、贫血、黄疸、水肿等症状。最急性病例比较少见，到发现时病马已死亡或濒死。该病在世界分布广泛，在欧洲，法国、意大利及俄罗斯南部和东部大部分地区，直至北纬58度地区，都有驽巴贝斯虫病流行的报道。法国南部驽巴贝斯虫病血清学调查流行率为11.3%，在南美洲、拉丁美洲、非洲、亚洲都有驽巴贝斯虫病的报道。巴西驽巴贝斯虫流行高达59.4% 至 65.5%  ，特立尼达岛也有驽巴贝斯虫病流行的报道。尼加拉瓜驽巴贝斯虫阳性率为41%，南非驽巴贝斯虫病血清学调查阳性率高达61.9%，蒙古驽巴贝斯虫病分布广泛，血清学调查阳性动物达40.1%。我国驽巴贝斯虫病主要流行于东北、内蒙古东部及青海等地，在我国有14个省区都曾有该病散发或地方性流行的报道。甘肃、黑龙江、吉林、新疆也是驽巴贝斯虫病流行地区。

马匹耐过驽巴贝斯虫病后，带虫免疫可持续达4年。疫区的马匹由于经常遭受蜱的叮咬，反复感染，因此一般不发病或只表现轻微症状而耐过，但由外地进入疫区的新马及新生的幼驹由于没有这种免疫性，容易发病。在没有疫情但有蜱类活动的地区，对外来马匹要严格进行驽巴贝斯虫病的检疫，防止带虫马进入。

由于该病在世界范围内分布广泛，为严重传播性疾病，难以根除，因此各国均把该病列为重要监测的马病之一，因此病对国际贸易产生重要影响，世界动物卫生组织（OIE）将该病列为对国际贸易产生重要影响的疾病，我国农业部将其列为二类动物传染病。在国际贸易中，大多数国家签署的双边检疫协定中，将该病列为法检项目。

由于该病感染动物后，常不表现为明显的临床症状，因此很难从症状上诊断。此类疾病主要是通过实验室检验方法进行确诊。病原鉴定主要通过血液涂片和PCR，实验室检验方法常采用血清学检测方法，主要有间接荧光抗体试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验(世界动物卫生组织(OIE).陆生动物诊断和疫苗手册[M], 2008:1-2.)。血液涂片法只有动物处于急性感染期才是可行的诊断方法， PCR目前虽已建立但仍需发展和完善，且PCR因受制于病原核酸的提取，其试验的敏感性和特异性还有待提高。间接荧光抗体试验敏感性不强，且容易受操作者主观因素影响结果判断。补体结合试验现为许多国家推荐的检验方法，但此法会受到抗补体因素的影响而不能判断样品的实验结果，酶联免疫吸附试验虽然操作简便，敏感性较强，但易发生交叉反应，出现假阳性结果。探讨研究新的检测方法是科学技术发展的必由之路，也是疾病检测技术发展的要求。

    免疫印迹法是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术，但多用于鉴定某种蛋白，将其用于疫病检测方面的研究并不多。 

国内用免疫印迹法检测动物疫病的研究很少，没有关于驽巴贝斯虫病免疫印迹检测方法的研究报道。

发明内容

本发明人进行了大量的实验工作，终于建立了一种驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断试剂盒的制备方法。本发明采集健康小型马红细胞体外培养驽巴贝斯虫，经过扩大培养，将获得的培养物制成免疫印迹诊断抗原，并经实验室感染马匹获得驽巴贝斯虫抗体阳性对照血清。 同时，在获得诊断抗原和阳性对照血清的基础上建立了驽巴贝斯虫病免疫印迹检测方法。

本发明目的是提供一种驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断试剂盒及其制备方法，本发明目的通过以下技术方案实现：

（1）制备虫体培养用红细胞：

无菌采集健康马血，离心处理后用VYM’s缓冲液洗涤、悬浮得到；

离心条件：4℃-8℃，低速， 30±5 min；

（2）建立及扩大驽巴贝斯虫体外培养

无菌采集感染驽巴贝斯虫病马的抗凝血，经离心处理，用3x VYM’s缓冲液洗涤、悬浮获得染虫红细胞后，采用HL-1组织培养液培养，当染虫率达到1.5%-2%时即进行分代培养；之后每当染虫率达到2%或以上时即扩大培养；