[发明专利]一种驽巴贝斯虫病免疫印迹检测方法及试剂盒制备

权利要求书

1.一种驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断试剂盒，其特征在于包括：

（1）驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断抗原

（2）辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗马结合物

（3）阳性对照血清、阴性对照血清

（4）底物

（5）蛋白分子量标准标记物

（6）4 -12 % Bis-Tris胶

（7）硝酸纤维膜

（8）MOPS  SDS Running Buffer

（9）NuPAGE Antioxidant

（10）转印缓冲液

（11）磷酸盐缓冲液

（12）封闭液

（13）洗液

(14)感光胶片

(15)使用说明书

所述底物是peroxide solution+Luminol enhancer solution）

根据权利要求1所述一种驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断试剂盒，其特征在于试剂盒中的驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断抗原通过下述方法制备：

（1）制备虫体培养用红细胞：

无菌采集健康马血，离心处理后用VYM’s缓冲液洗涤、悬浮得到；

离心条件：4℃-8℃，低速， 30±5 min；

（2）建立及扩大驽巴贝斯虫体外培养

无菌采集感染驽巴贝斯虫病马的抗凝血，经离心处理，用3x VYM’s缓冲液洗涤、悬浮获得染虫红细胞后，采用HL-1组织培养液培养，当染虫率达到1.5%-2%时即进行分代培养；之后每当染虫率达到2%或以上时即扩大培养；

培养环境为：93%N₂，2.0%O₂，5%CO₂；一个培养周期为24 小时； 

（3）制备驽巴贝斯虫病免疫印迹杂交诊断抗原

当步骤（2）培养物的染虫率超过3%时，收集培养物，经离心、洗涤，最后以PI buffer+1%NP40溶解至清亮，再加入 LDSsample buffer（4x） 、ample Reducing Agent（10x），充分混匀；煮沸，迅速冷却，即得驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断抗原。

2.根据权利要求1所述一种驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断试剂盒，其特征在于底物是peroxide solution+Luminol enhancer solution。

3.根据权利要求1所述一种驽巴贝斯虫病免疫印迹诊断试剂盒，其特征在于试剂盒中的阳性对照血清通过下述方法制备：

将25mL用等量10%常规异源马血清磷酸盐缓冲液混合的驽巴贝斯虫红细胞培养物，静脉注射至脾未切除的小型马体内，3天后用大约10000个蜱（约0.5克）未饲喂的蜱幼虫，装在一个布袋中，放置在小型马上。

4.13天后拿走已变成饱满的蛹的蜱，蜱养6天，第6天将蜱放到实验用小型马匹上8天，两个星期后采集血清，补体结合试验可检测到驽巴贝斯虫抗体，即获得阳性对照血清。