[发明专利]一种双荧光质粒、基于其的活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物学研究领域，尤其涉及一种双荧光质粒及其应用，以及一种基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法。

背景技术

目前，分析生物体错配修复(MMR)功能活性的传统方法有三种：即以噬菌体M13mP2及其衍生株为材料的分析方法、以寡聚核苷酸为材料的分析方法以及基于酵母MMR功能的分析方法。这三种MMR功能分析模型都是以细胞核提取物来进行MMR功能活性的评价，均属于体外分析法，不能准确反应生物体内的真实状况，且存在分析过程复杂、指示参数灵敏度和准确度低、不易统计等缺点。因此，这三种方法主要应用于对特定生物体MMR功能活性的分析，很难在致癌机理与致癌风险评价中获得实际的应用与推广。

2004年美国德州大学孙鲁浙(Lu-zhe SUN)教授所领衔的研究团队首次提出利用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein，EGFP)作为报告基因直接对活细胞DNA MMR活性进行定量分析的模型，其成果发表在国际著名学术期刊NucleicAcids Res(2004，32，(12)，e100)上。此后，研究发现，该模型所使用的一对质粒中EGFP突变型质粒(EGFP基因起始密码ATG→ACG)并没有像预期的那样转染细胞后完全终止EGFP的表达，那 么以其提供的模板链所制备的异源双链核酸分子导入活细胞后错配在未被修复的情况下也无法完全终止EGFP的表达，这势必会增加EGFP的背景值从而削弱该模型的检测灵敏度与精度。此外，如何得到大规模高纯度的核酸分子也成了制约该模型得到推广应用的瓶颈。

为了进一步优化上述活细胞DNA MMR功能活性定量分析模型，Anal Biochem(2009，388，(1)，167-9)上提出了一种方法，通过采取一种无义突变策略(在EGFP基因合适位置引入终止密码子造成一个T/G错配)，彻底消除了该模型原有的EGFP本底表达问题；同时，还开发出了一种高效快捷的方法来大规模制备高纯度的核酸分子，该成果发表在Anal Biochem(2009，389，(2)，177-9)上。优化后的模型的确提高了原有模型的分析精度与灵敏度，同时为该模型的推广应用创造了一定的前提。但是此模型在实际操作中，校正各细胞处理组间EGFP质粒转染效率和EGFP表达强度上的差别是通过平行转染另一种RFP真核表达质粒来实现的，EGFP基因和RFP基因是位于两种不同质粒和开放阅读框内，因此以RFP作为参照标准来校正各细胞处理组间参数，是很难实现单细胞水平上校验准确性的。

发明内容

本发明的目的是构建一对双荧光质粒，解决现有技术中单色荧光质粒共转染所产生单细胞水平上校验准确性差的问题。

本发明的另一个目的是提供一种基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法，方法简单、指示参数灵敏度高和准确度高。

为此，本发明是通过以下技术方案实现：一种双荧光质粒，携带有EGFP和RFP基因，其中，EGFP和RFP基因位于同一阅读框。

同时，本发明还提供了一种基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法，包括以下步骤：(1)构建两个上述的双荧光质粒P1和P2，其中质粒P1中的EGFP基因为正常表达，质粒P2中的EGFP基因具有无义突变；(2)以质粒P1为材料制备单链DNA分子；(3)基于质粒P1和P2，以及单链DNA分子，制得同源和异源核酸双链分子；(4)将同源和异源核酸双链分子分别转染至活细胞，进行错配修复功能活性分析。

进一步地，步骤(1)中采用双顺反子克隆技术使得EGFP基因和RFP基因位于同一阅读框中。

进一步地，上述双顺反子克隆技术包括以下步骤：分别以pGEM-EGFP质粒和pGEM-(mt)EGFP质粒为模板，以具有SEQ No.1序列的上游引物和具有SEQ No.2序列的下游引物扩增EGFP基因；其中，pGEM-EGFP中的EGFP基因为正常表达，而pGEM-(mt)EGFP中的EGFP基因存在无义突变；将扩增得到的所述正常表达的EGFP基因酶连入具有RFP基因的载体p IRES2-Dsred2制得所述双荧光质粒P1，将扩增得到的所述存在无义突变的EGFP基因酶连入具有RFP基因的载体p IRES2-Dsred2制得所述双荧光质粒P2。