[发明专利]一种双荧光质粒、基于其的活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法及其应用

权利要求书

1.一种双荧光质粒，携带有EGFP和RFP基因，其特征在于，

所述EGFP和RFP基因位于同一开放阅读框。

2.一种基于双荧光质粒检测活细胞内DNA错配修复功能活性的分析方法，包括以下步骤：

(1)分别构建两个权利要求1所述的双荧光质粒P1和P2，其中所述质粒P1中的EGFP基因为正常表达，所述质粒P2中的EGFP基因具有无义突变；

(2)以所述质粒P1为材料制备单链DNA分子；

(3)基于所述质粒P1和P2，以及所述单链DNA分子，制得同源和异源核酸双链分子；

(4)将所述同源和异源核酸双链分子分别转染至所述活细胞，进行DNA错配修复功能活性分析。

3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用双顺反子克隆技术使得所述EGFP基因和RFP基因位于同一阅读框中。

4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述双顺反子克隆技术包括以下步骤：

分别以pGEM-EGFP质粒和pGEM-(mt)EGFP质粒为模板，以具有SEQ No.1序列的上游引物和具有SEQ No.2序列的下游引物扩增EGFP基因；其中，所述pGEM-EGFP中的EGFP基因为正常表达，而pGEM-(mt)EGFP中的EGFP基因存在无义突变；

将扩增得到的所述正常表达的EGFP基因酶连入具有RFP基因的载体p IRES2-Dsred2制得所述双荧光质粒P1，将扩增得到的所述存在无义突变的EGFP基因酶连入具有RFP基因的载体p IRES2-Dsred2制得所述双荧光质粒P2。

5.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述双顺反子克隆技术包括以下步骤：

以pIRES2-Dsred2质粒为模板，所述pIRES2-Dsred2质粒中含有RFP基因，以具有SEQ No.3序列的上游引物和具有SEQNo.4序列的下游引物扩增带有RFP的基因片段；

将扩增得到的所述带有RFP的基因片段分别酶连入pGEM-EGFP载体和pGEM-(mt)EGFP载体，其中，所述pGEM-EGFP中的EGFP基因为正常表达，而pGEM-(mt)EGFP中的EGFP基因存在无义突变，制得所述质粒P1和质粒P2。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述存在无义突变的EGFP基因是由正常表达的EGFP基因经具有SEQ No.5序列的第一引物和具有SEQ No.6序列的第二引物诱变PCR扩增制成。

7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述质粒P2中EGFP基因的第58三联密码子处具有无义突变。

8.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(2)包括如下步骤：

以质粒P1为材料，使用缺刻酶形成带缺刻的开环质粒，然后使用核酸外切酶进行消化反应获得所述单链DNA分子。

9.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(2)包括如下步骤：

以质粒P1为材料，使用辅助噬菌体M13ko7，通过侵染的方法获得高纯单链DNA分子。

10.权利要求1所述的双荧光质粒在制备用于检测活细胞内DNA错配修复功能活性试剂中的应用。