[发明专利]一种用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系

说明书

背景技术

实蝇科（Tephritidae）是双翅目（Diptera）中最大的类群，世界上已经描述的实蝇种类超过4500余种，有70余种被认为是农业上的重要害虫，已对农林作物生产构成威胁。现阶段，在实蝇的口岸检疫鉴定工作中, 主要以成虫的外部形态特征作为分类依据, 若截获的是幼虫或卵, 则需对其进行室内饲养，待获得成虫后再进行鉴定，造成检疫周期长,不利于检疫性害虫发现与防控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明的用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系，总体积为25μl：模板DNA 50ng，dNTP 200 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5μl，引物0.25μmol/L，Taq 酶0.5U，最后加ddH₂O至25μl；ISSR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；52℃退火45s，72℃延伸90s；共36个循环；最后72℃延伸10min。

1、模板DNA的制备。

所述模板DNA的制备如下：

取实蝇成虫，加入800μl提取缓冲液,于冰浴中充分研磨后移入1.5 ml Eppendorf管中，加0.5mg/ml蛋白酶K，混匀后于65℃水浴1h，加入8mol/L KAc100μl，使其充分混匀，然后冰浴1h，4℃下12000r/min离心20min，取上清液加入800μl预冷的无水乙醇，混匀，冰浴2h，12000r/min离心20min，取沉淀用70%的乙醇洗涤1次，5000r/min离心5min，沉淀于37℃干燥4～6min，最后加入10μl RNA酶和40μl TE溶解，37℃水浴1h,4℃保存备用；所述提取缓冲液配制为：0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，0.2mol/L蔗糖，0.05mol/L EDTA，0.5% SDS。

为了得到上述技术方案，本申请人进行了一系列有益的试验：

本发明的分子反应体系从模板浓度、引物浓度、dNTP 浓度和Taq DNA聚合酶用量等影响ISSR 反应的4个主要因素着手，优化了适合于实蝇ISSR-PCR扩增反应的最佳反应条件，进而建立了一套用于揭示实蝇种群遗传多样性的分子反应体系。

（1）ISSR-PCR反应体系的优化

基准反应体系（总体积25 μl）：模板DNA 20 ng，dNTP 200 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5μl，引物0.20 μmol/L，Taq酶1 U，最后加ddH₂O 至25μl。

① dNTP 浓度优化：在模板浓度、引物浓度、Taq DNA 聚合酶用量等其它条件不变的情况下，设计100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L 等5个dNTP 浓度梯度，检验dNTP 浓度对ISSR反应的影响，以寻找最适浓度。

②引物浓度优化：在模板浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶用量等其它条件不变的情况下，设计0.15 μmol/L、0.20 μmol/L、0.25 μmol/L、0.30 μmol/L、0.35 μmol/L 等5个引物浓度梯度，检验引物浓度对ISSR反应的影响，以寻找最适浓度。

③ Taq 酶用量优化：在模板浓度、引物浓度、dNTP 浓度等其它条件不变的情况下，设计0.5 U、0.75 U、1 U、1.25 U、1.5 U等5 个Taq 酶用量梯度，检验Taq酶用量对ISSR反应的影响，以寻找最适用量。

④ 模板浓度优化：在引物浓度、dNTP 浓度、Taq DNA聚合酶用量等其它条件不变的情况下，设计了25、50、75、100、125 ng 等5个DNA模板用量梯度，检验模板DNA浓度对ISSR反应的影响，以寻找最适浓度。

（2）ISSR-PCR扩增产物的检测

以DNA Marker DL 2000为标准分子量，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，电压110V，电泳时间40 min，将胶块放到EB 染色液中染色10 min，再用清水漂洗，BIO-RAD 凝胶成像仪观察，拍照保存。

（3）ISSR-PCR反应体系的建立