[发明专利]用于甲基化DNA的富集和测序的半甲基化接头及其用途

说明书

发明领域

本发明属于分子生物学领域。特别地，本发明提供了用于分析样品DNA的甲基化状况的半甲基化接头，包含此类半甲基化接头的试剂盒，此类半甲基化接头和试剂盒的用途，以及使用此类半甲基化接头分析样品DNA的甲基化状况的方法。

发明背景

DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，因此，DNA甲基化已成为目前新的研究热点之一^[1-3]。

目前研究DNA甲基化的方法主要包括以下几种。

一种方法通过用重亚硫酸盐(Bisulfite)处理DNA并进行测序来进行DNA甲基化的研究。该方法是研究甲基化最常用也是最准确的方法，其在完成大规模测序分析后可对一些特异位点进行甲基化特异性PCR(MSP&BSP)验证。该方法的缺陷是，对于一些大基因组而言(例如，对于人类基因组3G，测序需要至少100G以上的数据)，测序规模庞大，成本过高，不适宜大样本量的比较性研究^[4]。

另一种方法利用全基因组芯片杂交技术来研究全基因组甲基化状况。该方法包括：对DNA进行重亚硫酸盐处理；将处理后的DNA与设计好的全基因组甲基化芯片杂交，从而通过杂交的结果来体现甲基化和非甲基化信息；并且杂交得到的DNA序列可通过测序或PCR来验证。该方法的主要问题在于，由于杂交技术本身的缺陷而导致的实验的灵敏度和重复性不好，不能用于进行精确的甲基化研究和大样本量样本的比较性研究^[1-3]。

另外一种方法将甲基化敏感(非敏感)类限制性内切酶与重亚硫酸盐分析法结合起来，通过比较酶切位点信息来研究DNA的甲基化(RRBS、MMSDK)。此类方法规模小且易操作，但其只能对全基因组范围内能够被所用的限制性内切酶识别的位点进行甲基化研究，因此该方法同样不能用于进行全基因组范围的精确甲基化研究。

另一种方法利用甲基化DNA特异性结合抗体或甲基化特异性结合蛋白对全基因组范围的甲基化DNA进行富集，然后通过高通量测序(MeDIP-SEQ、MBD-SEQ)来研究甲基化信息。此类方法能够对全基因组范围的甲基化DNA进行选择性研究，但是由于蛋白和DNA的相互作用受到很多未知因素的影响，因此，该方法的重复性不好。另外，由于免疫反应得到的DNA没有进行重亚硫酸盐处理，因此，该方法不能实现对单个碱基进行精确甲基化研究^[4]。

因此，迫切需要开发新的DNA甲基化分析方法，以帮助快速、全面和精确地分析全基因组的DNA甲基化状态。

发明内容

除非另有定义，否则本文中所使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。为了更好的理解本发明，特别提供了下列术语的定义。

如本文中所使用的，“接头”通常是双链核酸分子，其长度可以为至少20个碱基，至少30个碱基，至少40个碱基，至少50个碱基，至少60个碱基，至少70个碱基，至少80个碱基或更多个碱基。

如本文中所使用的，术语“半甲基化的接头”是指这样的接头，所述接头的正链的胞嘧啶(C)全部被甲基化修饰，而负链的胞嘧啶全部未被甲基化修饰。

如本文中所使用的，术语“接头的正链”是指接头中在连接反应后连接至目的DNA片段的核苷酸链的5′端的那条链，术语“接头的负链”是指接头中在连接反应后连接至目的DNA片段的核苷酸链的3′端的那条链。

在一个方面，本发明提供了半甲基化的接头，其中，接头的正链的胞嘧啶(C)全部被甲基化修饰，而负链的胞嘧啶全部未被甲基化修饰。

在一个优选实施方案中，半甲基化的接头的正链的5′端序列与其负链的3′端序列不互补，并且正链的3′端序列与负链的5′端序列互补(即，半甲基化的接头是“分叉的”)，优选，互补部分的长度可以为例如至少10个碱基，至少20个碱基，至少30个碱基，至少40个碱基或至少50个碱基。在另一个实施方案中，半甲基化的接头的正链和负链完全互补。不受任何理论束缚，现认为，“分叉的”半甲基化接头有利于控制接头与DNA片段连接的方向，避免不必要的错连。

在另一个实施方案中，本发明的半甲基化的接头的正链的3′端或负链的5′端具有悬突，所述悬突的长度可以为1个，2个，3个，4个，5个，6个或更多个碱基。在一个优选实施方案中，本发明的半甲基化接头的正链的3′端具有单个碱基(例如，碱基T)的悬突。