[发明专利]用于甲基化DNA的富集和测序的半甲基化接头及其用途

权利要求书

1.一种半甲基化的接头，所述接头的正链的胞嘧啶(C)全部被甲基化修饰，而负链的胞嘧啶全部未被甲基化修饰，其中，

优选，所述接头的正链的5′端序列与其负链的3′端序列不互补，并且正链的3′端序列与负链的5′端序列互补，或者所述接头的正链和负链完全互补；

优选，所述接头的正链的3′端或负链的5′端具有悬突，更优选，所述接头的正链的3′端具有单个碱基(例如，碱基T)的悬突。

2.包含权利要求1的半甲基化的接头的试剂盒，其中，

优选，所述接头的正链和负链分别以单链形式单独存在，或，所述接头以双链形式存在；

优选，所述试剂盒还包括其他试剂，例如用于分析样品DNA的甲基化状况的其他试剂，例如，能够与经重亚硫酸盐处理的所述半甲基化接头的负链退火的引物，能够与所述接头的正链的互补链退火的引物，针对重亚硫酸盐处理后的所述接头而特别设计的引物，经第一分子实体修饰的dCTP，以及与第一分子实体特异性结合的第二分子实体；

优选，所述第一分子实体和第二分子实体是抗原和抗体或抗原结合片段，或者配体和受体，或者生物素和亲和素；

优选，经第一分子实体修饰的dCTP是生物素修饰的dCTP，例如生物素-11-dCTP，并且第二分子实体是链霉亲和素磁珠；

优选所述试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况。

3.权利要求1的半甲基化的接头和/或权利要求2的试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况的用途，优选，所述样品DNA是文库DNA或基因组DNA，例如细菌，病毒，植物或动物的基因组DNA，优选哺乳动物的基因组DNA，特别是人的基因组DNA。

4.权利要求1的半甲基化的接头用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于分析样品DNA的甲基化状况。

5.用于分析样品DNA的甲基化状况的方法，其包括以下步骤：

1)将权利要求1的半甲基化的接头连接至待分析的样品DNA的两端，从而得到连接产物；

2)用重亚硫酸盐处理步骤1)中的连接产物，以将非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；

3)以重亚硫酸盐处理后的产物为模板，用能够与经重亚硫酸盐处理的半甲基化接头的负链退火的引物进行第一次互补链合成，从而得到第一次互补链合成产物；

4)用尿嘧啶糖基化酶处理步骤3)中的第一次互补链合成产物，以除去含有尿嘧啶的DNA链；

5)以尿嘧啶糖基化酶处理后的产物为模板，加入dTTP、dATP、dGTP以及经第一分子实体修饰的dCTP，并使用能够与半甲基化接头的正链的互补链退火的引物，进行第二次互补链合成，从而得到第二次互补链合成产物；

6)使用能够与第一分子实体特异性结合的第二分子实体，富集并分离掺入了经第一分子实体修饰的dCTP的第二次互补链合成产物，从而得到分离产物；

7)对步骤6)中的分离产物进行测序分析，其中，除了所使用的接头序列外，分离产物中的胞嘧啶即为所述样品DNA中被甲基化的胞嘧啶；

其中，

优选，所述样品DNA是文库DNA或基因组DNA，例如细菌，病毒，植物或动物的基因组DNA，优选哺乳动物的基因组DNA，特别是人的基因组DNA；

任选地，在步骤1)之前，对所述样品DNA进行片段化，优选通过雾化法、超声片段化法、HydroShear法或酶切处理法，更优选通过超声片段化法将所述样品DNA片段化；

优选，通过平端连接法，TA连接法，粘性末端连接法将所述接头连接到所述样品DNA的两端，并且特别优选的连接方法是TA连接法；

优选，所述第一分子实体和第二分子实体是抗原和抗体或抗原结合片段，或者配体和受体，或者生物素和亲和素，更优选第一分子实体是生物素，并且第二分子实体是链霉亲和素；

优选，经第一分子实体修饰的dCTP是生物素修饰的dCTP，例如生物素-11-dCTP，并且第二分子实体是链霉亲和素磁珠；

任选地，在对步骤6)中的分离产物进行测序分析之前，使用针对重亚硫酸盐处理后的半甲基化接头而特别设计的引物对分离产物进行PCR扩增；

优选，对步骤6)中的分离产物进行高通量测序分析，例如使用SOLEXA、SOLID和Roche 454测序平台进行高通量测序分析；

任选地，在任意两个相邻步骤之间，进行产物的回收和纯化，优选，在所有步骤之间进行产物的回收与纯化。