[发明专利]葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一个来源于葡萄的病程相关蛋白基因PR10-1，其体外融合蛋白水解RNA，及抑制病原菌生长的方法。属于植物基因工程领域。

背景技术

在长期自然进化过程中，植物体内形成一套很好的防御机制对外界环境的生物和非生物胁迫做出反应，这种防御机制是由许多正调控基因的表达来完成的，其中主要包括植物木质素、羟脯氨酸糖蛋白、裂解酶、蛋白酶抑制剂和一类小分子量PR蛋白。病程相关蛋白(PR)是植物受生物或非生物胁迫后诱导产生并积累的一类蛋白质，是植物防卫体系的重要组分部分。近年来，根据PR蛋白一级序列结构、血清学关系和生物学活性将已发现的PR蛋白分为17个亚类，基中一类具有类RNA酶的蛋白定义为第十类PR蛋白，即PR10。PR10基因开放读码框编码的氨基酸中都具有一个高度保守的“P-LOOP”结构域，这是一类广泛存在于磷酸化激酶和核酸结合蛋白的结构域，该区域的磷酸化与其RNA酶活性相关，而RNA酶活性则在防御病原体感染中起作用。PR10最先是在用激发子处理过的欧芹培养细胞中发现的。Flores等在2002年《植物生理学》128：1291-1302中报道，酢浆草PR10在体外有抑制细菌和真菌的作用，而Chen等在2010年《分子植物病理学》11(1)：69-81中报道，玉米PR10蛋白有体外抑制黄曲霉的作用。此外，从桦树、棉花、花生等植物中分离纯化的PR10均证实有体外RNA酶活性。

葡萄白粉病是遍布世界各葡萄生产区的严重真菌病害。葡萄白粉菌可以侵染葡萄的叶片、果实及新梢等幼嫩组织。葡萄白粉病流行年份对果实品质和产量往往造成很大的损失，同时还影响枝条的生长发育及葡萄第二年的生长发育。目前各葡萄产区栽培的葡萄优良品种多数对白粉病抗性较低，防治的主要方法是化学防治方法，这种防治方法不仅对土壤、水质等造成污染，而且影响葡萄及其加工产品的品质。长期使用抗病药物还会使病原菌产生抗药性。我国是世界葡萄属植物最重要的原产地之一，拥有丰富多样的野生葡萄资源。这些资源不仅丰产性好，对主要真菌病害具有极强的抗性，是重要的抗病基因资源。然而，传统的抗病基因功能验证需要将基因首先转入葡萄，而葡萄遗传转化效率低下，一直是其基因功能验证的瓶颈，这个过程相当耗费人力、财力与时间，其结果未必能筛选出大量真正抗病的基因。

发明内容

为加快筛选出中国野生葡萄抗病基因资源，以高抗葡萄白粉病的中国野生华东葡萄白河-35-1为实验材料，获得一个葡萄病程相关蛋白基因PR10-1cDNA全长序列827bp(GenBank登陆号DQ336289)，其中80bp-559bp的480bp开放阅读框构建GST融合载体，将融合载体导入原核系统表达出的PR10-1融合蛋白能水解酵母tRNA、并体外抑制烟草赤星病菌的生长，为此，本发明提供葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌的方法。

本发明是通过以下方法实现的：

根据中国野生葡萄病程相关蛋白基因480bp开放阅读框构建突变体K55N、E149G、Y151H，将PR10-1基因及其突变体K55N、E149G、Y151H四个基因，分别插入原核表达载体pGEX-4T-1中，使其与GST标签处于同一读码框，将构建好各重组质粒导入大肠杆菌BL21中，在BL21中经IPTG诱导表达出融合蛋白，通过超声破碎法从BL21细胞中分离并纯化出PR10-1和突变体融合表达蛋白，将纯化好的融合蛋白加入到酵母tRNA液中，以煮沸变形的融合蛋白为阴性对照，以来源于大肠杆菌RNase为阳性对照，检测各融合蛋白的RNA酶活性，将加入不同量的融合蛋白到PDA培养基培养的烟草赤星病菌中，黑暗培养5天后观测赤星病病菌生长情况，用无菌去离子水从培养基表面洗下病菌后，在紫外分光光度计595nm测定病菌孢子悬浮液OD值，量化融合蛋白对赤星病菌生长的抑制。