[发明专利]葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法

权利要求书

1.葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法，其特征在于：根据中国野生葡萄病程相关蛋白基因480bp开放阅读框构建突变体K55N、E149G、Y151H，将PR10-1基因及其突变体K55N、E149G、Y151H四个基因，分别插入原核表达载体pGEX-4T-1中，使其与GST标签处于同一读码框，将构建好各重组质粒导入大肠杆菌BL21中，在BL21中经IPTG诱导表达出融合蛋白，通过超声破碎法从BL21细胞中分离并纯化出PR10-1和突变体融合表达蛋白，将纯化好的融合蛋白加入到酵母tRNA液中，以煮沸变形的融合蛋白为阴性对照，以来源于大肠杆菌RNase为阳性对照，检测各融合蛋白的RNA酶活性，将加入不同量的融合蛋白到PDA培养基培养的烟草赤星病菌中，黑暗培养5天后观测赤星病病菌生长情况，用无菌去离子水从培养基表面洗下病菌后，在紫外分光光度计595nm测定病菌孢子悬浮液OD值，量化融合蛋白对赤星病菌生长的抑制。

2.根据权利要求1所述的葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法，其特征在于：

2.a PR10-1融合蛋白的表达与纯化

2.a.1根据中国野生华东葡萄白河-35-1病程相关蛋白基因PR10-1全长序列827bp中的480bp开放阅读框，分别设计含有NdeI和XhoI内切酶位点的野生型和点突变型引物：

PR10F：5’gggcatatgatgggtgttttcacttacgag3’；

PR10R：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgc 3’；

K55NF：5’ggaaccatcaacaagattcac3’；

K55NR：5’gtgaatcttgttgatggttcc 3’；

E149GR：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgcaatgatgtaggctccaat3；’

Y151HR：5’gggctcgagttaataggcatcagggtgtgcaatgatgtgggc 3’，

运用重叠嵌套延伸PCR方法对PR10-1蛋白中三个与RNA酶活性和抗真菌活性有关的保守氨基酸残基lys55、glu149和tyr151分别进行点突变，替换为asn55、gly149和his151；将上述所获得的PCR产物用NdeI和XhoI内切酶酶切后，用T₄DNA酶连接到pGEX-4T-1原核表达载体上，转化大肠杆菌BL21菌株、克隆、测序；

2.a.2PR10-1及突变体原核表达，分别挑取PR10-1野生型，及其突变体Y151H、K55N和E149G单菌接种于6ml含100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃180rpm培养16小时；从培养好的菌液中吸取200μL接于新鲜6ml含100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃180rpm培养3小时，至其OD值为0.6；从上述菌液中吸取1ml于离心管中作为空白对照，并向剩余菌液中加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，于30℃继续培养4小时诱导融合蛋白的表达；导后的菌液中吸取1ml于离心管中，收集为A组、B组；然后将空白对照组及收集后的A组、B组分别于12,000rpm离心2分钟，弃上清；向B组加入大肠杆菌蛋白提取液200μL并涡旋30分钟，然后13,000rpm离心5分钟，取上清100μL于新的离心管中；加入10μL 1M DTT和90μL 2×SDS；向对照组和A组中加入20μL 1M DTT和180μL 1×SDS，涡旋混匀；所有样品于沸水中煮沸5分钟，13000rpm离心5分钟，每个样品取30μL进行SDS-PAGE；

2.a.3PR10-1及突变体融合蛋白的纯化，收集50ml诱导后的菌液，8,000rpm离心5分钟，倾去上清，在沉淀中加入3ml PBS，超声波破碎后，8000rpm离心10分钟，将上清转移到新的离心管中待用；轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆；取1ml匀浆放入50ml离心管中，4℃10000rpm离心5分钟，吸去上清；在树脂中加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒数次，混合均匀，4℃10000rpm离心5分钟，吸去上清；在上述树脂中加入8ml预冷的PBS，制成50％的匀浆，轻轻颠倒数次，混合均匀，匀浆冰上放置；超声破碎的细胞裂解物加入到准备好的树脂匀浆中，4℃轻摇30分钟，使树脂上的谷胱甘肽与融合蛋白上的GST充分结合；将混合物于4℃以8000rpm离心10分钟，吸去上清；沉淀中加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒离心管5次，洗去未与树脂结合的蛋白；在4℃，8000rpm离心10分钟，吸去上清，再加入8ml预冷的PBS，轻轻颠倒离心管5次，在4℃，8000rpm离心10分钟；在沉淀中加入800μL预冷的谷胱甘肽洗脱缓冲液，4℃轻轻摇动30分钟，洗脱树脂上结合的蛋白；在4℃，8000rpm离心10分钟，收集上清，转移至干净的离心管，再向在沉淀中加入800μL预冷的谷胱甘肽洗脱缓冲液，4℃轻轻摇动30分钟，在4℃，8000rpm离心10分钟，将上清转移至前次的收集离心管中；取20μL二次收集的混匀的上清进行SDS-PAGE，检测融合蛋白的纯化情况，剩余上清于-20℃保存待用；

2.b运用纯化所得PR10-1及突变体融合蛋白分别对RNA进行水解与体外抑菌，

2.b.1PR10-1及突变体融合蛋白对RNA的水解，取11支无RNase的离心管，加入450μg从Sigma公司购得酵母tRNA和150μL pH7.0的Tri s-Hcl，分别加入未处理过的蛋白样品PR10-1、Y151H、K55N、E149G和预先煮沸过的蛋白样品，使蛋白样品终浓度为0.27μg/μL，加入未处理过的RNase和煮沸过的RNase终浓度为0.27μg/μL，加入还原型谷胱甘肽缓冲液终浓度为50mM，37℃水浴1小时后，加入等体积氯仿，震荡摇匀后冰上静置10分钟，琼脂糖电泳检测；

2.b.2PR10-1及突变体融合蛋白的体外抑菌，在PDA固体培养基上接种烟草赤星病病菌，28℃黑暗培养7天，用无菌水将表面孢子冲洗下来，并用灭菌后的三层纱布过滤得孢子悬浮液，血球计数板法计孢子数，确定孢子悬液浓度为1.2×10⁵孢子/ml，取24孔的细胞培养板，在75％的乙醇中浸泡30分钟，再用无菌水冲洗干净，最后紫外线照射30分钟，在灭菌后的细胞培养板中，每孔中分别加入40ul孢子悬浮液，和纯化后的各种蛋白，蛋白终浓度为0.67μg/ul，28℃黑暗条件培养5天，观察结果并照相，细胞培养板中每一孔的菌体均用1ml无菌水冲洗下来，收集于1.5ml的离心管中，用无菌水稀释10倍后，在595nm下测定孢子液OD值。