[发明专利]葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶催化白藜芦醇生成紫檀芪的方法无效
申请号: | 201010582548.3 | 申请日: | 2010-12-03 |
公开(公告)号: | CN102120996A | 公开(公告)日: | 2011-07-13 |
发明(设计)人: | 徐炎;王跃进;许腾飞;赵霄晨;李凤菊;李志谦 | 申请(专利权)人: | 西北农林科技大学 |
主分类号: | C12N15/09 | 分类号: | C12N15/09;C12N15/82;C12N15/54;C12P7/22;C12Q1/68 |
代理公司: | 西安集思得知识产权代理有限公司 61210 | 代理人: | 张晋吉 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 葡萄 藜芦 甲基转移酶 催化 生成 紫檀 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一个来源于葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶基因重组表达载体构建,及在转基因烟草中合成紫檀芪的方法,属于植物基因工程领域。
背景技术
白藜芦醇的3个酚羟基具有很强的供电子能力,是白藜芦醇具强抗氧化能力的原因,白藜芦醇羟基类似物的抗氧化活性与酚羟基的数量和位置有关。因此,在白藜芦醇的两个苯环上增加或减少羟基数量以及改变羟基的位置所得化合物往往也有与白藜芦醇相同的药理作用。由于分子中有3个酚羟基,白藜芦醇很不稳定,极易被氧化,生成紫檀芪。所以人们试图用化学手段对酚羟基进行保护,以增强其稳定性,而报道较多的是将其甲基化。白藜芦醇甲基化衍生物对人体前列腺癌细胞的抑制作用,与白藜芦醇相比,这些衍生物的活性较强或相似,其中白藜芦醇的三甲基化产物活性最强。
紫檀芪(Pterostilbene:3,5-二甲氧基-4’-羟基反式二苯乙烯),是檀香紫檀袋状雌器苞的一种活性成分,檀香紫檀袋状雌器苞在传统医学中可用于治疗糖尿病。此外,紫檀芪可以减少肝甘油三酯的生成并促进血浆甘油三酯的降解,从而降低血浆甘油三酯水平。Jang M等在《科学》1997年275:218-220报道紫檀芪具有类似于白藜芦醇的抗氧化和抗癌特性。
紫檀芪可在少数几种植物的器官中生成积聚,其中包括紫檀木(P.santalinus)和越桔浆果(Vaccinium berries)的木质部。紫檀芪还被确定为欧洲葡萄(Vitis vinifera)的一种植保素,Jeandet等在《农业食品化学》2002年50:2731-2741研究认为紫檀芪能比白藜芦醇高5-10倍的抑制葡萄灰霉病分生孢子的萌发和霜霉病孢子囊的产生。
尽管其具有高抗真菌活性及其诱人的药理特性,在葡萄中紫檀芪的生物合成途径尚未被研究清楚。因此,克隆和分析葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶(ROMT)催化白藜芦醇生成紫檀芪的基因功能;获得葡萄ROMT催化白藜芦醇生成紫檀芪的高效、实用表达系统,对今后培育优质高抗植物新品种具有重要意义。
发明内容
为获得具有保健功能且抗病的粮食、水果、蔬菜作物,本发明公开了一种葡萄ROMT催化白藜芦醇生成紫檀芪的方法,获得一个葡萄ROMT基因序列,此ROMT基因在转基因烟草中能催化白藜芦醇生成紫檀芪,为利用植物合成紫檀芪提供ROMT基因序列和方法。
本发明是通过以下方法实现的:
以中国葡萄属野生种华东葡萄高抗白粉白粉病株系“白河-35-1”为材料,用病叶压片法人工接种葡萄白粉菌,在接种诱导0,24,48,72,96,120和144小时提取总RNA,根据获得的中国野生葡萄华东葡萄ROMT基因EST序列,利用5’和3’RACE全长基因克隆技术克隆葡萄ROMT基因,该基因开放阅读框全长为1074bp;芪合成酶基因(STS)催化合成白藜芦醇,通过构建植物表达载体pWR306::STS做为检测阳性对照,构建pWR306::GUS做为阴性对照,此外,构建pWR306::ROMT;用农杆菌介导的叶盘转化法获得以下四种转基因烟草植株:pWR306::GUS转基因烟草植株;pWR306::STS转基因烟草植株;葡pWR306::ROMT转基因烟草植株;以及葡萄pWR306::STS和pWR306::ROMT共转基因烟草植株;利用Real-time PCR法分析不同转基因烟草植株的基因表达差异,获得上述高表达GUS、STS、ROMT、以及STS和ROMT共表达转基因烟草植株,采用高效液相色谱分析这四种筛选出的高表达转基因烟草植株中白藜芦醇和紫檀芪的含量,确定ROMT基因功能。
本发明克隆的葡萄STS和ROMT能同时转入模式植物烟草中,利用烟草植物分析葡萄ROMT催化白藜芦醇生成紫檀芪的生物合成途径,为定向获得优质、抗病、保健作物提供依据。
附图说明
附图1为本发明转葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶基因烟草代表植株图。
植物表达载体pWR306为组成型35S启动子,图示左图是pWR306::GUS转基因烟草植株为阴性对照;右图是葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶基因转基因烟草植株。
附图2为本发明转葡萄芪合成酶基因烟草代表植株图。
图示左图是pWR30G::GUS转基因烟草植株为阴性对照;右图是葡萄芪合成酶基因转化烟草植株为阳性对照。
附图3为本发明共转化葡萄芪合成酶基因和白藜芦醇-氧-甲基转移酶基因烟草代表植株图。
图示左图是pWR306::GUS转基因烟草植株为阴性对照;右图是葡萄芪合成酶基因和白藜芦醇-氧-甲基转移酶基因共转化烟草植株。
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