[发明专利]葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶催化白藜芦醇生成紫檀芪的方法

权利要求书

1.葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶催化白藜芦醇生成紫檀芪的方法，以中国葡萄属野生种华东葡萄高抗白粉白粉病株系“白河-35-1”为材料，用病叶压片法人工接种葡萄白粉菌，在接种诱导0，24，48，72，96，120和144小时提取总RNA，根据获得的中国野生葡萄华东葡萄ROMT基因EST序列，利用5’和3’RACE全长基因克隆技术克隆葡萄ROMT基因，该基因开放阅读框全长为1074bp；其特征在于：芪合成酶基因(STS)催化合成白藜芦醇，通过构建植物表达载体pWR306::STS做为检测阳性对照，构建pWR306::GUS做为阴性对照，此外，构建pWR306::ROMT；用农杆菌介导的叶盘转化法获得以下四种转基因烟草植株：pWR306::GUS转基因烟草植株；pWR306::STS转基因烟草植株；葡pWR306::ROMT转基因烟草植株；以及葡萄pWR306::STS和pWR306::ROMT共转基因烟草植株；利用Real-time PCR法分析不同转基因烟草植株的基因表达差异，获得上述高表达GUS、STS、ROMT、以及STS和ROMT共表达转基因烟草植株，采用高效液相色谱分析这四种筛选出的高表达转基因烟草植株中白藜芦醇和紫檀芪的含量，确定ROMT基因功能。

2.根据权利要求1所述的葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶催化白藜芦醇生成紫檀芪的方法，其特征在于：

2.a ROMT基因的克隆与表达载体构建

以中国葡萄属野生种华东葡萄株系“白河-35-1”为材料，根据中国野生葡萄华东葡萄ROMT基因EST序列，利用5’和3’RACE全长基因克隆技术克隆ROMT，获得基因开放阅读框全长为1074bp；

2.b ROMT基因植物表达载体的构建

2.b.1将ROMT开放阅读框插入双元载体pWR306的35S启动子后构建成pWR306-ROMT，

2.b.2将STS基因开放阅读框插入双元载体pWR306的35S启动子后构建成pWR306-STS做为阳性对照，

2.b.3空载体pWR306做为阴性对照，

2.b.4将构建好的载体分别采用电击法转入到农杆菌GV3101中获得工程菌；

2.c ROMT催化白藜芦醇紫檀芪生成方法

2.c.1烟草遗传转化；

2.c.2将NC89烟草种子浸入清水中5分钟，纱布过滤，用清水冲洗，再用70％酒精浸8秒，放入0.1％升汞溶液中消毒3分钟，无菌水冲洗10次，接种于无外源激素的MS培养中；

2.c.3在26℃、光照强度1500Lux、日光照13小时的组培室中培养，待叶片生长到7片叶后进行叶盘转化；

2.c.4挑取pWR306-STS/GV3101、pWR306-ROMT/GV3101、pWR306/GV3101工程菌单菌落，接种于含Kan 50μg/mL和Gent 60μg/mL的液体LB培养基中，28℃150rpm振荡培养16小时，取200μL该菌液接种于20mL液体LB培养基中相同条件下培养至生长对数期；

2.c.5取上述3种工程菌菌液，4℃，5000rpm，离心5分钟；

2.c.6收集沉淀，并用含1.0mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、pH5.6的MS液体培养基重悬沉淀，后置于28℃恒温摇床，200rpm，培育至OD600＝0.5；

2.c.7从无菌烟草试管苗上剪取自上而下第三、四片完全展开的叶片，切成0.5×0.5cm的叶盘，将其浸入培育好的农杆菌菌液中5分钟；

2.c.8取出叶盘，置于无菌滤纸上，除去叶盘表面多余农杆菌菌液；

2.c.9将上述叶盘转入含1.0mg/L 6-BA、3％蔗糖、0.6％琼脂、200μM/L乙酰丁香酮、pH5.8的共培养MS培养基，25℃，黑暗条件下共培养2天；

2.c.10将共培养后的烟草叶盘转入含1.0mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、25mg/L HygB、500mg/L Carb、3％蔗糖、0.6％琼脂、pH5.8的选择分化培养MS基培养基，25℃培养，每隔2周转接一次；

2.c.11待叶盘上的芽长到1.5cm高时，切下芽转移到含0.3mg/L NAA、25mg/L HygB、300mg/L Carb、3％蔗糖、0.6％琼脂，pH5.8的生根选择MS培养基中，进行生根培养；

2.c.12叶盘转化法中转化的菌液有以下四种，空载体菌液pWR306/GV3101作为阴性对照、pWR306-STS/GV3101、pWR306-ROMT/GV3101以及pWR306-STS/GV3101和pWR306-ROMT/GV3101共转化，其中共转化中的两种菌液体积的比例为1∶1；

2.c.13挑选已具4片真叶且根系发育良好的再生植株，打开瓶盖置于温室中炼苗6天，将再生植株移出培养瓶，洗净根上的培养基，移至温室盆栽；

2.c.14转基因烟草植株DNA小量提取法，采用改良CTAB微量提取法提取总DNA，步骤如下：取再生植株叶片0.5g，放入1.5mL离心管中，加400μL提取缓冲液，缓冲液中含有pH7.5 Tris 200μM、NaCl 250μM、pH8.0EDTA 25mM、SDS 0.5％，迅速充分研磨，4℃，12000rpm/分钟离心5分钟，将上清转移到2mL离心管中，加入0.35mL冰冷酚：氯仿/异戊醇，其比例为24∶1，混匀，4℃，12000rpm/分钟离心15分钟，将上清转入新2mL离心管中，加入预冷的等体积异丙醇，充分混匀，65℃的水浴5分钟，离心5分钟，将上清转移至1.5mL离心管中，加入2倍体积的70.％预冷乙醇，-20℃沉淀3小时，4℃，12000rpm离心10分钟，去上清，空气干燥10分钟，用20μL TE缓冲液溶解，-20℃保存备用；

2.c.15转化植株的PCR检测

提取总DNA进行PCR检测，引物分别为STS-F/STS-R，ROMT-F/ROMT-R和GUS-1F/GUS-1R，引物序列如下：同时以质粒pWR306-STS，pWR306-ROMT，pWR306作为阳性对照，

STS-F：5’-TAGGATCCATGGCTTCAGTTGAGGAAAT-3’

STS-R：5’-GCACTAGTTTAATTTGTAACCATAGG-3’

ROMT-F：5’-GGGGGATCCCATCATCATCATCATCATATGGATTTGGCAAATGGT-3’

ROMT-R：5’-GGGGAGCTCAAGGATAAACCTCAAT-3’

GUS-1F：5’-GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG-3’

GUS-1R：5’-GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA-3’

2.c.16四种转基因烟草总RNA提取，采用SDS/酚法对检测到白藜芦醇和紫檀芪含量的烟草，以及阴性对照烟草提取烟草总RNA；First-Strand cDNA合成，第一链cDNA合成采用TakaRa的TaKaRaPrimeScriptTM RT试剂盒，操作步骤见此试剂盒说明书；转基因在烟草中的检测采用Real-Time PCR法，反应体系为Premix Ex TaqTMII12.5μL、PCR 10μM Forward Primer 1.0μL、10μM Reverse Primer 1.0μL、ddH2O 9.5μL，最后用ddH2O将反转录获得的cDNA液稀释5倍，取1μL加入到Real-Time PCR反应体系中，烟草Actin基因作为内参基因，引物为Actin-F与Actin-R，序列如下：

Actin-F：5’-CATTGGCTCAGAGAGGTTCAGAT-3’

Actin-R：5’-TTCCACCACTAAGGACGATGTTT-3’

2.c.17芪合成酶基因和白藜芦醇氧甲基转移酶基因引物分别为RTSTS-F/RT STS-R，RT ROMT-F/RT ROMT-R，引物序列如下，反应在BIO-RADiCycleriQ 5荧光定量PCR仪进行，采用两步法，95℃预变性10秒，然后在94℃变性5秒、60℃退火34秒、延伸34秒条件下扩增40个循环，最后在60℃进行荧光信号采集，扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量PCR仪软件自动生成，

RT STS-F：5’-GCCATTGCTAACGCTTTCCCACAT-3’

RT STS-R：5’-TCACGCATTCTTCATCGCTCCAGT-3’

RT ROMT-F：5’-ATTTCAGGGTCACTAAGAGCG-3’

RT ROMT-R：5’-AGCCTTCAATGCTGCTTCCTT-3’

2.c.18旋蒸发提取转基因烟草叶片组织白藜芦醇和紫檀芪及高效液相色谱法测定含量，称取4.5g新鲜烟草叶片，置于预冷的研钵中避光充分研磨，将固体粉沫转入包锡箔纸的离心管中，用45mL 80％甲醇润洗研钵3次，并转入到离心管中，在25℃，80Hz超声波提取30分钟，4℃避光静置提取10小时，样品在室温7000rpm离心15分钟，将分离出的上清液在旋转蒸发仪上真空状态下以80r/分钟、在25℃旋转蒸发至3ml，分别加入10ml、5ml、5ml乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，25ml，3％碳酸氢钠洗涤3次，乙酸乙酯相分离并弃去水相，再分别用25ml的去离子水洗涤3次乙酸乙酯相，弃去水相，将乙酸乙酯相真空条件下旋转蒸干，加入4ml色谱甲醇溶解样品，用高效液相色谱测定，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 5μm 4.6×250mm，二元梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为水，流动相洗脱程序为起始1％A，99％B，保持5分钟；到28分钟时A为60％，B为40％；33分钟时A为85％，B为15％，保持2分钟；到40分钟时A为1％，B为99％，平衡柱子，进下一个样，流速为1.0mL/分钟；柱温为30℃；检测波长为306nm；进样体积为20μL，含量计算方法采用外标一点法。