[发明专利]鉴定花椰菜抗黑腐病的特异引物Ⅱ及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的鉴定花椰菜抗黑腐病的引物II及其利用该引物序列鉴定花椰菜抗黑腐病的方法。

背景技术

黑腐病是由黄单胞杆菌属细菌(Xanthomonascam pestrispv.cam pestris)引起，不仅危害甘蓝类蔬菜，且危害其他十字花科蔬菜。在世界多数地区，病害的发生常常是毁灭性的。近年来由于人民生活水平的提高，花椰菜种植面积不断扩大，而生态环境又适宜该病的发生蔓延。因此，花椰菜黑腐病呈逐年加重趋势，严重影响花椰菜的产量和品质，造成巨大的经济损失。

该病菌主要危害花椰菜的叶片，有时也危害花球。幼苗受害时，子叶呈水浸状并逐渐变褐枯萎，或蔓延至真叶，使叶片的叶脉呈长短不等的小条斑。成株期发病，病菌多从叶缘水孔和伤口处入侵，自叶缘开始向内形成“V”形黄褐色病斑，致病叶发黄，叶脉变黑，如病菌侵入茎部维管束，可引起植株萎蔫。花球受害，一般从花梗开始，颜色变成灰黑色，最后小花球呈灰黑色干腐状，失去食用价值。

花椰菜的抗病育种是提高产量和质量的有效途径之一，抗病品种的选育已成为花椰菜育种的长久目标，目前采用田间接种鉴定植株抗病性费时费力，而且易受环境等多种因素的影响，准确度差。随着分子生物学技术的发展，特别是DNA分子标记技术的发展可以为这些研究提供准确、快捷的辅助手段。由于DNA分子标记不存在表达与否的问题，可以直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受取材部位、时间、发育时期和环境的影响，信息量大，准确率高，为抗黑腐病品种的早期筛选、缩短抗病育种年限带来广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是克服现有筛选抗病品种技术的不足，提供一种快速、早期筛选花椰菜抗黑腐病品种的引物序列，和利用该引物鉴定花椰菜抗黑腐病品种的鉴定方法。

本发明的技术方案概述如下：

鉴定花椰菜抗黑腐病的引物II，它由引物序列II-S和引物序列II-A组成。

一种使用特异引物II鉴定花椰菜抗黑腐病品种的方法，它包括如下步骤：(1)花椰菜基因组DNA提取。(2)PCR扩增；在0.2ml PCR专用薄壁离心管中加入：PCR缓冲溶液2.5μl、10mmol/LdNTP0.5μl、10μmol/L引物序列II-S和引物序列II-A各0.5μl、花椰菜基因组DNA 50-100ng、Taq聚合酶2U、无菌水补至25μl，将装有上述溶液的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性45秒，56℃退火45秒、72℃延伸60秒，扩增30个循环，最后在72℃延伸480秒，扩增完成。(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.2％的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0.5μg/ml)；在5μl扩增产物中及标准阳性Marker分别加入1μl 6×上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，120V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长265nm)或在凝胶成像仪上进行观察。(4)依照标准DNA marker带在凝胶上的位置鉴定花椰菜是否抗黑腐病。

附图说明

图1是利用特异引物II和方法对已知抗、感黑腐病花椰菜检测结果的电泳图，1，为标准分子量marker，2-10为抗病植株，特异条带为400bp；11-20为感病植株的检测结果，无400bp条带

图2是利用特异引物II和方法进行田间随机检测结果的电泳图，显示400bp条带的为抗病植株，未显示条带的为感病植株。

具体实施方式

下面结合实施例子和附图对本发明做进一步的说明：

利用引物II，对花椰菜抗黑腐病和感黑腐病植株的检测方法，具体步骤如下：