[发明专利]一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

畜禽和水产养殖业在国民经济中占有重要地位。高密度养殖方式在提高产量的同时，也导致养殖生物疾病滋生，造成巨大经济损失。目前普遍使用抗生素防治病害，但所造成的药物残留和病原菌抗药性等问题，危害人类健康和环境，并成为限制畜牧水产品出口的重要原因。在人们对食品安全日益关注的今天，寻找安全高效的抗生素替代品，发展健康养殖，已成为饲料学科的重要研究方向。目前，抗生素替代品主要通过抑制或杀死病原菌、改善肠道菌群、提高机体免疫力，以达到防病促生长的目的。

抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽，广泛存在于生物界。生物内源性的抗菌肽可经细菌感染诱导合成，在机体抵抗病原入侵方面起重要作用，更是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。天蚕素(Cecropins)是5类昆虫抗菌肽中抗菌活性较强的一种，其抗菌谱广，不仅能杀死细菌也能杀死一部分真菌；其杀菌机制是通过改变细菌细胞膜上的电势依赖通道，造成胞内物质泄漏而导致细菌死亡，这和抗生素通过阻断大分子生物合成不同，不易产生耐药菌，且对各种抗生素耐药菌也有杀伤作用；其还有分子量小、水溶性好及无免疫原性等特点；它具有较强热稳定性，在100℃加热10分钟还能保持一定活力，更适合饲料的高温加工过程；并且经过人造胃酸处理后，活性保持不变；它对人畜无害，在雏鸡中发现，Cecropins还有促生长的作用。将Cecropins作为饲料添加剂不仅可以替代饲用抗生素，杀灭消化道病原菌，达到防病促生长的作用，而且还可作为饲料的防腐剂使用，便于饲料储存。

目前，已有在毕赤酵母中表达果蝇Cecropin B的报道。但毕赤酵母表达异源蛋白需甲醇诱导，残留的甲醇可能带来毒害作用。酿酒酵母是美国食品和药品管理局公布的可用作饲料添加剂且对人畜无害的唯一酵母类微生物。酿酒酵母有成熟的异源基因表达系统，本身还是高蛋白饲料，酵母细胞壁还是一种免疫促进剂。因此，酿酒酵母更适合用来生产Cecropins作为饲料添加剂。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法。

一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法，步骤如下：

(1)将抗菌肽天蚕素基因(如SEQ ID NO.14所示)和多拷贝整合表达载体(如SEQ IDNO.1所示)分别用Not I酶切，然后用DNA连接酶连接后，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板，利用Not I进行酶切验证，经分析测序，选取反向插入cecA1片段的转化子命名为pYIP-cecA1；

(2)将步骤(1)制得的pYIP-cecA1用Hpa I酶切，回收大片段后，加入到80μL酵母电转化感受态细胞，将混合物电击后，经G418的YEPD平板的筛选，获得表达天蚕素的酵母细胞；

(3)培养步骤(2)制得的表达天蚕素的酵母细胞，经干燥，制得天蚕素饲料添加剂。

上述步骤(2)中电转化的电击时间为3.5～4.0ms。

上述步骤(3)中的培养条件：在无选择压力的YEPD培养基中28～30℃培养2～3天。

上述步骤(2)中的酵母为具有絮凝性的野生型酿酒酵母ABXL-1D，菌种购自美国ATCC公司。

所述的多拷贝整合表达载体的制备方法可参见中国专利申请号为：“201010531234.0”，发明名称为：“一种多拷贝整合表达载体及其制备方法与在表达牛乳铁蛋白中的应用的申请中的记载”。

酿酒酵母对人类无毒，被食品和药物管理局(FDA)确认为无害表达系统，表达产物可直接作为饲料添加剂应用，并且酿酒酵母的细胞壁成分β-1，3葡聚糖也是一种免疫增强剂。故本发明利用强絮凝型酿酒酵母组成型表达天蚕素，在工业生产中不需要分离工艺，复杂的蛋白纯化工艺，利用成本较低的发酵培养基即可进行发酵生产，发酵完毕后收集酵母，即可直接制成酵母干粉制剂作为饲料添加剂应用。