[发明专利]绵羊MSTN基因启动子区两个新SNP位点检测及其检测方法的建立

说明书

技术领域

本发明涉及绵羊肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)基因启动子区的两个单核苷酸多态性位点及其检测方法。

背景技术

绵羊肌肉的生长性状(包括产量和质量)决定着肉用绵羊的生产性能。产肉性能的好坏，除与绵羊的营养和饲养管理因素有关外，主要决定于遗传因素，即主要受与肌肉生长发育相关基因的调控。在过去十几年，大量的研究表明在绵羊2号染色体上存在影响绵羊肌肉生长性状的QTL。肌肉生长抑制素基因(Myostatin，MSTN)属于转化生长因子超家族成员，是近年来发现的一类重要的肌肉生长负调控因子，该基因的突变失活，能阻断MSTN对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低脂肪的沉积。到目前为止，在具有双肌性状的Texel羊和其它品种绵羊的MSTN编码区中均没有发现与肌肉生长相关的SNP位点。2006年，Alex Clop等发现Texel羊双肌性状产生的遗传机制是由于MSTN基因3’UTR的一个SNP位点(g+6723G-A)产生了新的mi RNA作用靶点，引起MSTN基因翻译后抑制，进而导致Texel羊的双肌性状。进一步研究表明，该位点与绵羊的肌肉产量和脂肪沉积显著相关。以上研究表明MSTN基因调控区的SNP可能发挥着重要的生物学作用。

因此本发明以国外引进品种陶赛特，特克赛尔，德国肉用美利奴和新疆地方品种阿勒泰羊，巴音布鲁克，巴士拜羊和多浪羊为试验材料，利用DNA测序技术对MSTN基因启动子区进行了单核苷酸多态性检测，在启动子区找到具有群体代表性的SNP，并进一步建立简单，经济PCR-RFLP方法检测心发现的SNP，为下一步进行启动子区域的SNP位点的生物学功能研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于：检测绵羊myostatin基因启动子区单核苷酸突变位点，并提供该等位基因突变的检测方法。

本发明的目的是这样实现的：绵羊MSTN基因启动子区两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，分以下步骤；

其1确定绵羊myostatin基因启动子区的两个单核苷酸突变位点，位于GeneBank序列，登记号：DQ530260；从起始密码子ATG开始第-959位和-784位，即为SNP位点(-959T/C，-784G/A)，表现为6种基因型(TT，TC，CC，GG，GA，AA)；

其2检测到上述突变等位基因的三条特异性引物，长度分别为22bp、22bp、21bp；其中P1引物F：TGAGAGTTTGATCCCTACAGAG，R：TGGCTTCTAGTCTTGAGGATT；用于MSTN基因的启动子区测序；P2引物F：TGAGAGTTTGATCCCTACAGAG，R：GAGCTGATTCATTTGACTACTTC；和P3引物F：GTAGTCAATCGAAACTGAAGT，R：CCCTGAATAAATTCTTAGCAC；分别结合到两个突变等位基因模板链上，扩增到等位基因突变的目的基因；

其3通过设计的寡核苷酸引物，对样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增到985bp和121bp片段的产物，利用Psp1406I和Rsa I限制性内切酶进行酶切分析，建立SNP位点的PCR-RFLP检测体系，进而得到两个单核苷酸突变位点的多态性。

所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，体外扩增；采集绵羊血液，使用肝素纳抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA；使用特异结合的核苷酸引物P1对基因组DNA模板进行体外扩增；PCR反应体系(25μL)：10×buffer 2.5μL，引物(10pmol/μL)各0.5μL，dNTP(10mmol/L)2μL，DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL；PCR反应程序：95℃5min；95℃30sec；51℃30sec；72℃1min30sec(P1)，1min(P2)，30sec(P3)35个循环；72℃10min。

所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，PCR-RFLP的检测：将-959位点酶切产物使用3％琼脂糖凝胶电泳检测，将Psp1406I酶切产生的基因型定义为CC(733bp，252bp)，TC(985bp，733bp，252bp)；将-784位点酶切产物使用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，针对-784位点设计一对错配引物，当G-A时就形成了Rsa I的酶切位点，导致酶切产生两个片段(101bp+20bp)。

所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，PCR扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司进行SNP位点的序列分析。