[发明专利]绵羊MSTN基因启动子区两个新SNP位点检测及其检测方法的建立

权利要求书

1.绵羊MSTN基因启动子区两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于：分以下步骤；

其1确定绵羊myostatin基因启动子区的两个单核苷酸突变位点，位于GeneBank序列，登记号：DQ530260；从起始密码子ATG开始第-959位和-784位，即为SNP位点(-959T/C，-784G/A)，表现为6种基因型(TT，TC，CC，GG，GA，AA)；

其2检测到上述突变等位基因的三条特异性引物，长度分别为22bp、22bp、21bp；其中P1引物F：TGAGAGTTTGATCCCTACAGAG，R：TGGCTTCTAGTCTTGAGGATT；用于MSTN基因的启动子区测序；P2引物F：TGAGAGTTTGATCCCTACAGAG，R：GAGCTGATTCATTTGACTACTTC；和P3引物F：GTAGTCAATCGAAACTGAAGT，R：CCCTGAATAAATTCTTAGCAC；分别结合到两个突变等位基因模板链上，扩增到等位基因突变的目的基因；

其3通过设计的寡核苷酸引物，对样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增到985bp和121bp片段的产物，利用Psp1406I和Rsa I限制性内切酶进行酶切分析，建立SNP位点的PCR-RFLP检测体系，进而得到两个单核苷酸突变位点的多态性。

2.依据权利要求1所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于：体外扩增；采集绵羊血液，使用肝素纳抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA；使用特异结合的核苷酸引物P1对基因组DNA模板进行体外扩增；PCR反应体系(25μL)：10×buffer 2.5μL，引物(10pmol/μL)各0.5μL，dNTP(10mmol/L)2μL，DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL；PCR反应程序：95℃5min；95℃30sec；51℃30sec；72℃1min30sec(P1)，1min(P2)，30sec(P3)35个循环；72℃10min。

3.依据权利要求1所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于：PCR-RFLP的检测：将-959位点酶切产物使用3％琼脂糖凝胶电泳检测，使Psp1406I酶切产生的基因型定义为CC(733bp，252bp)，TC(985bp，733bp，252bp)；将-784位点酶切产物使用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，针对-784位点设计一对错配引物，当G-A时就形成了Rsa I的酶切位点，导致酶切产生两个片段(101bp+20bp)。

4.依据权利要求1所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于：PCR扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司进行SNP位点的序列分析。

5.依据权利要求1所述两个新SNP位点检测及其检测方法的建立，其特征在于：选用的试剂盒、药剂均为市售产品。