[发明专利]吗啡-氯胺酮胶体金法毒品检测试卡

权利要求书

1.一种吗啡-氯胺酮胶体金法毒品检测试卡，其特征是：本发明由一个封闭的塑料外壳包装而成,该外壳的上层开有显色孔和加样孔,在外壳内腔装有磁白板，磁白板上覆有膜结构，膜结构由下至上依次叠放样品垫，吸水纸, 玻璃纤维素膜和硝酸纤维素膜；其中玻璃纤维素膜上包被有胶体金标记鼠抗氯胺酮单克隆抗体和胶体金标记鼠抗吗啡单克隆抗体；硝酸纤维素膜上含有吗啡、氯胺酮抗原和一种羊抗鼠多克隆抗体；与显色孔对应的硝酸纤维素膜上用点膜机分别划定两条检测线和一条质控线，其中一条检测线为氯胺酮完全抗原，另一条检测线为吗啡完全抗原；质控线为纯化后的羊抗鼠IgG 多抗。

2.根据权利要求1所述的一种吗啡-氯胺酮胶体金法毒品检测试卡，其特征是：所述的玻璃纤维素膜上包被的胶体金标记鼠抗氯胺酮单克隆抗体由如下方法制成：（1）、氯胺酮结合抗原制备：用重氮化法将半抗原氯胺酮偶联于载体蛋白BSA,形成偶联抗原；制备过程如下, 取5毫克氯胺酮溶于0.1摩尔/升 HCl ,并预冷至0～5℃,加入10毫克NaNO₂,4℃搅拌6小时；然后加入20毫克BSA(预先溶于0.1摩尔/升 磷酸盐缓冲液,pH8.6),4℃继续搅拌6小时；用葡聚糖凝胶SephadexG-25凝胶过滤纯化偶联物,纯化后冻干存于4℃备用；（2）、小鼠免疫：以BSA偶联氯胺酮免疫8 周龄BALB/C小鼠15 只,免疫剂量50微克/只,皮下分点注射；共免疫3 次,每次免疫间隔3周；最后1次免疫10天后,断尾采血分离血清,用间接ELISA 法检测血清抗体效价；若效价>10^-4即可用于细胞融合；（3）、脾细胞的制备：末次免疫后3天摘眼球取血分离血清，并同时处死，浸泡碘酒5分钟，无菌解剖取脾，用RPMI1640培养液洗二次后，研磨通过100目不锈钢网，获得游离细胞，再用氯化铵法溶解祛除红细胞，然后计数脾细胞并用10％FBS-RPMI 1640培养液配制成2X10⁸个/毫升浓度用于细胞融合；（4）、SP2/0细胞的培养与细胞融合：复苏SP2/0细胞，于10％FBS-RPMI1640培养液中培养至对数生长期后配成4 X10⁷个/ml细胞浓度；分别取配制的上述浓度的脾细胞和SP2/0细胞各1毫升混合，使其比例为5：1；然后加入50%PEG 1毫升，于37℃，5%CO2孵箱内培养进行细胞融合；（5）、融合细胞的培养及阳性杂交瘤的筛选与克隆：融合后的细胞置37℃,5%CO₂培养箱中以HAT、HT 培养基选择培养；用间接ELISA法以BSA偶联氯胺酮微克/毫升包被酶标板进行阳性筛选；对强阳性、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化；（6）、抗氯胺酮单克隆抗体的测定与制备：给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株10⁷个细胞,7天后抽取腹水,以硫酸钠盐析法提纯抗体,测其ELISA效价；以检测样品于492纳米波长测得吸光值与阴性对照的比值≥2.1定为阳性，出现阳性结果的最大稀释倍数为抗氯胺酮单克隆抗体的效价；测定后结果作为使用时稀释倍数的依据；（7）、胶体金制备：将容积为1升三角烧瓶置于加热磁力搅拌器上,加入500毫升蒸馏水,加热搅拌至90℃时，加入0.5毫升10%氯金酸溶液；将此溶液煮沸5分钟,加入1.00毫升12%柠檬酸三钠溶液,保持此溶液沸腾10分钟,把此溶液从加热磁力搅拌器上取下；待温度将至25℃时，装到洁净容器内,4℃避光保存；（8）、胶体金-氯胺酮单克隆抗体结合物的制备：已制备好的胶体金100毫升,用0.1摩尔/升碳酸钾将溶液调至pH9.0;在磁力快速搅拌下迅速加入抗氯胺酮单克隆抗体5毫克, 搅拌10分钟后加入10% 牛血清白蛋白1毫升，继续搅拌10分钟; 高速冷冻离心机于4℃，12000转/分钟离心30 分钟；弃上清, 沉淀即为胶体金-氯胺酮单克隆抗体结合物；用0.01摩尔/升、pH8.2 PBS缓冲液稀释至一定浓度后,均匀浸在玻璃纤维膜上,37℃ 干燥备用。