[发明专利]超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法

说明书

发明领域

本发明属于分析化学领域，涉及超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，具体而言，涉及天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。

技术背景

黄嘌呤氧化酶是生物体内广泛存在的一种黄素蛋白酶，它属于钼蛋白酶家族，是体内核酸代谢途径的关键酶。黄嘌呤氧化酶催化底物黄嘌呤和次黄嘌呤氧化成尿酸，并产生超氧阴离子(O^-₂·)和过氧化氢(H₂O₂)。尿酸浓度过高会导致高尿酸血症，并且随着尿酸在关节处的沉积结晶可引起痛风发作。超氧阴离子自由基则与炎症，癌变和衰老相关。近几年的研究还发现黄嘌呤氧化酶在缺血再灌注组织和血管损伤，炎症疾病和慢性心力衰竭中也起着重要的作用。而作为临床应用的黄嘌呤氧化酶抑制剂药物只有上世纪60年代上市的别嘌呤醇，但是它有很多副作用，应用后病人可有发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少，甚至有肝功能损害等副作用。所以寻找黄嘌呤氧化酶抑制剂和研究黄嘌呤氧化酶抑制剂在临床中的应用对于开发新药有着非常重要的意义。

黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选一般使用光谱法，其不足之处在于光谱法易受到背景干扰，可能得到假阳性或假阴性结果(Akihiko Nagao，Michiko Sehi，Hidetaka Kobayashi，Biosci.Biotechnol.Biochem63(1999)1787-1790；Chunmao Lin，Chienshu Chen，Chientsu Chen，Yuchih Liang，and Jenkun Lina，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 294(2002)167-172)；也曾有人为了克服光谱法中的缺点而采用液相色谱法进行黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，但是液相色谱方法所需的样品用量大，耗费的时间长(Akihiko Nagao，MichikoSehi，Hidetaka Kobayashi，Biosci.Biotechnol.Biochem 63(1999)1787-1790)。质谱方法最大的优势在于它的检测本质是基于一个分子的质荷比。现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分(Gejing Deng，Gautam S anyal.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40(2006)528-538)。酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相色谱进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R.de Boer，Thomas Letzel，Danny A.van Elswijk，Henk Lingeman，Wilfried M.A.Niessen，andHubertus Irth.Anal.Chem.2004，76，3155-3161)。

发明内容

本发明的目的是提供超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法。本发明可用于分析天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。

本发明所述的天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶的体外抑制是指天然产物提取物或单体抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而导致酶促反应底物黄嘌呤的剩余量增加，产物尿酸的量减少；

本发明所述的黄嘌呤氧化酶催化活性是指在37℃，黄嘌呤氧化酶催化底物生成尿酸的量，也可以用底物黄嘌呤减少的量来表示。

本发明包括以下内容：以黄嘌呤为底物，黄嘌呤氧化酶在37℃催化底物生成尿酸，用超高效液相色谱和质谱联用对黄嘌呤进行定量，通过计算底物黄嘌呤含量的变化得到黄嘌呤氧化酶的活性，进一步计算出黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率。

本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其包括以下步骤：

所述的超高效液相色谱，与高效液相色谱相比具有超高分离度，超高速度和超高灵敏度；

所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是天然产物提取物或单体；本发明优选别嘌呤醇、异鼠李素、染料木素或银杏水提物；

(1)酶促反应缓冲液的配制