[发明专利]超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法

权利要求书

1.超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其包括以下步骤：

所述的超高效液相色谱，与高效液相色谱相比具有超高分离度，超高速度和超高灵敏度；

所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是天然产物提取物或单体；

(1)酶促反应缓冲液的配制

酶促反应缓冲液包括50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔/升盐酸，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8.9；

(2)标准品的配制

用2摩尔/升的氨水溶液将标准品分别配成浓度为1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、15微摩尔/升或20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的牛磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为黄嘌呤；黄嘌呤是黄嘌呤氧化酶的底物；

(3)对照品、空白样品和样品的酶促反应

对照品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；

空白样品的配制：反应总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；

样品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔/升的黄嘌呤氧化酶抑制剂于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；

(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测

对标准品检测：采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取黄嘌呤和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以黄嘌呤与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1微摩尔/升至20微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到黄嘌呤的线性方程：

y＝ax+b

式中，y为所述的标准品黄嘌呤与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R²；

①超高效液相色谱的检测条件

超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY；

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50毫米，1.7微米)；

流动相：甲醇(A)和水(B)；

梯度洗脱程序：0～1分钟，20％A～60％A；1～2分钟，60％A～100％A；2～3分钟，100％A～20％A；3～5分钟，20％A；所指的百分比均为体积百分比；

流速：0.2毫升/分钟；

进样量：5微升；

②质谱条件

质谱仪：Waters Xevo TQ；

离子源：电喷雾(ESI)电离源负离子模式；

毛细管电压：2000伏特；

去溶剂气氮气温度：350摄氏度；

去溶剂气氮气流速：800升/小时；

锥孔气氮气流速：50升/小时；

碰撞气氩气流速：0.15升/小时；

第一个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为15.0；离子能量为：0.5；

第二个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为13.5；离子能量为：0.5；

以上所述质谱条件在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；

锥孔电压在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的：检测黄嘌呤时锥孔电压是28伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30伏特；

碎裂能量和选择的碎片离子在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的：检测黄嘌呤时碎裂能量是20，碎片离子是107.98；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30，碎片离子是124.08；

对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；

(5)黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率

黄嘌呤氧化酶抑制剂天然产物提取物或单体抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而导致酶促反应底物黄嘌呤的剩余量增加，产物尿酸的量减少；所以抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率可以通过底物黄嘌呤含量或者产物尿酸含量的变化进行评价；本发明是利用底物黄嘌呤含量的变化进行计算的；

分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品、空白样品和样品中黄嘌呤浓度，黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式计算：

I_样品＝(C_样品-C_对照)/(C_空白-C_对照)×100％

式中，I为黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率；

C_样品为根据线性方程求得的样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔/升；

C_对照为根据线性方程求得的对照品中黄嘌呤的浓度，量纲为微摩尔/升；

C_空白为根据线性方程求得的空白样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔/升。