[发明专利]与小麦白粉病抗性基因PmHNK54连锁的标记引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及小麦抗白粉病基因的标记引物，属分子遗传学领域，特别是涉及与小麦白粉病抗病基因PmHNK54紧密连锁的标记引物及其在分子标记辅助育种中的应用。

背景技术：

小麦白粉病是由小麦白粉病菌[ Blumeria graminis (DC) Speer f. sp. Tritici，简称为Bgt]所引起的一种气传性真菌病害，为世界各主要麦区的主要病害之一，且发病范围日益扩大，危害程度不断加重，可引起 13.4%～34% 的产量损失。选育和使用高效抗病品种是最经济、安全、有效的解决办法，根据“基因对基因”假说，任何抗病基因都会出现克服其抗性的毒性小种，反之亦然，二者呈共进化的关系，即一个新的抗病基因在经过一段时间的应用后，就会有针对它的毒性小种出现，使其逐渐丧失抗病性，给小麦生产造成严重损失。因此，发掘新的白粉病抗源已成为目前小麦抗白粉病育种工作一项非常迫切的任务。

到目前为止，国际小麦基因命名委员会共正式命名了来自43个位点的 61个白粉病抗病基因（powdery mildew, Pm）（Pm1-Pm43），其中35个抗病基因已找到连锁或共分离的分子标记。近年来，分子标记作图技术发展迅速，众多的分子标记类型中以简单重复序列标记（SSR）、扩增长度多态性标记（AFLP）以及由限制性片段长度多态性标记（RFLP）转化的序列标签位点（STS）标记应用最为广泛。新发掘的白粉病抗病基因所构建的遗传图谱基本都是应用的这三类标记。

随着小麦基因组学研究的蓬勃发展，表达序列标签（EST）数据库的信息量呈现出指数级增长，截止 2008年11月小麦 EST 数据库登录的 EST 序列  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)已超过 1,250,932条，同时EST-SSR 因具有成本低、特异性好等优点，为新的标记开发提供了丰富的序列资源，已成为SSR标记发展的一个新方向。

小麦近缘种属如一粒小麦、二粒小麦、粗山羊草等已成为白粉病新抗病基因非常重要的来源(Pm30-Pm37, Pm41-Pm43)，这些抗病基因多为质量抗性，对当前流行的生理小种有较好的抗性。但这类抗源往往与不利的农艺性状相连锁，作为抗源导入栽培品种时，后代需要经过多代回交打破与不利基因的连锁，有的甚至经过多代回交以后仍无法打破这种连锁，这在很大程度上制约了此类抗源在育种中的应用。

发明内容：

本发明要解决的技术问题：提供一种与小麦白粉病抗性基因PmHNK54紧密连锁的标记及其应用，通过发掘到的分子标记，首次对小麦亲本材料郑 9754中的白粉病抗性新基因进行染色体定位，同时构建其连锁图谱，为该基因在小麦白粉抗病育种中的应用提供抗源材料和理论支持。

本发明的技术方案：

与小麦白粉病抗性基因PmHNK54连锁的标记引物，所述标记引物的核苷酸序列为：

标记引物Xbarc5，

P1：5’-GCGCCTGGACCGGTTTTCTATTTT-3’，

P2：5’-GCGTTGGGAATTCCTGAACATTTT -3’，

或者标记引物Xgwm312，

P3：5’-ATCGCATGATGCACGTAGAG -3’，

P4：5’-ACATGCATGCCTACCTAATGG -3’。

所述标记引物在遗传图谱上的顺序为Xbarc5、PmHNK54、 Xgwm312，所述标记引物Xbarc5与基因PmHNK54的遗传距离为5.0cM，所述标记引物Xgwm312与PmHNK54的遗传距离为6.0 cM。

将标记引物用于SSR标记筛选时的反应程序为：

(1) PCR反应： 

所述PCR反应体系为10μl，含10×buffer 1μl，10 mM/μl dNTP 0.2μL，20 uM/μL 引物 0.2μl，5 U/ul Taq 酶 0.1ul，去离子水 8.1 μl，20 ng/μl 基因组DNA 0.4 μl；

 (2) 扩增程序为：94℃ 预变性 3 min，94℃变性1 min，55℃或60℃复性1 min，72℃延伸 2 min, 40个循环；72℃延伸10 min；