[发明专利]含斜带石斑鱼促性腺激素Ⅰ成熟肽基因的真核表达载体、重组菌株和重组蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及的是一种含有斜带石斑鱼促性腺激素I成熟肽基因的克隆载体、表达载体、重组菌株和重组蛋白及其应用。

背景技术

促性腺激素(gonadotropin hormone，GTH)是由脑下垂体产生的两个亚单位的糖蛋白，其作用的靶组织是精巢和卵巢，其生理功能主要是增加性腺类固醇激素的生成与分泌，促进配子生成，性腺发育成熟和排精排卵。促性腺激素(gonadotropin hormone，GTH)分为两种类型，即促性腺激素I(GTH I，又称卵泡雌激素(follicle-stimulating hormone，FSH))与促性腺激素II(GTH II，又称黄体生成素(luteinizing hormone，LH))，促性腺激素I是由GTHα与FSHβ组成的异二聚体，促性腺激素II是由GTHα与LHβ组成的异二聚体。斜带石斑鱼促性腺激素α亚基含有10个Cys残基，形成5个分子内二硫键，成熟肽含有94个氨基酸，第一个氨基酸残基是Ala，信号肽含有23个氨基酸残基；FSH β亚基含有11个Cys残基，形成5个分子内二硫键，成熟肽含有99个氨基酸，信号肽含有21个氨基酸残基，N-连接糖基化位点和O-连接糖基化位点不保守。一般认为，促性腺激素I即卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)主要在性腺发育早期起作用，即卵黄生成期和精子生成期由脑垂体大量分泌产生，并对刺激性腺组织分泌产生雌二醇和睾酮起主要作用，经学者研究，FSH在促排精排卵中同样起着重要的作用。

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides(orange-spotted grouper))属鲈形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑鱼亚科(Epinephelinae)石斑鱼属(Epinephelus)，主要分布于沿海近礁水域，为雌性先熟的雌雄同体鱼类。繁殖季节为4～10月间，以4～5月为盛期。斜带石斑鱼是我国华南沿海一带及东南亚地区重要的海水养殖鱼类，肉质细嫩，味美，经济价值较高。石斑鱼性腺发育与排精排卵的不同步制约了石斑鱼的养殖生产，目前现有的催产剂如使用hCG或鱼类脑垂体提取物等，成本较高而且效果不稳定。因此，利用生物技术开发高效安全的鱼类催产剂具有重要的经济价值。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种含有斜带石斑鱼促性腺激素GTHα或FSHβ成熟肽基因的克隆载体。

本发明的第二个目的在于提供一种由大肠杆菌和斜带石斑鱼促性腺激素GTHα或FSHβ成熟肽基因构建而成的重组菌株。

本发明的第三个目的在于提供一种含有斜带石斑鱼促性腺激素GTHα和/或FSHβ成熟肽基因的真核表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种由含有斜带石斑鱼促性腺激素GTHα和/或FSHβ成熟肽基因的真核表达载体转化毕赤酵母构建制成的重组菌株。

本发明的第五个目的在于提供一种重组促性腺激素成熟肽基因及其制备方法。

本发明的最后一个目的在于提供上述重组促性腺激素成熟肽基因在鱼类催产中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种克隆载体，含有斜带石斑鱼促性腺激素GTHα或FSHβ成熟肽基因。

本发明用于表达斜带石斑鱼GTHα、FSHβ及FSH重组蛋白的GTHα与FSHβ成熟肽基因序列是以斜带石斑鱼脑垂体总RNA反转录产物cDNA为模板，经PCR方法扩增得到的，它们分别来源于斜带石斑鱼FSH单亚基基因GTHα与FSHβ的相应基因片段。

上述GTHα与FSHβ成熟肽基因序列，它们分别为斜带石斑鱼FSH单亚基基因GTHα全长基因70bp至354bp(相当于24位氨基酸至终止密码子)的片段以及单亚基基因FSHβ全长基因64bp至363bp(相当于22位氨基酸至终止密码子)的片段，它们的碱基序列如序列表SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

上述克隆载体的构建方法是按照常规方法，将通过PCR方法扩增的目的片段即斜带石斑鱼促性腺激素GTHα或FSHβ的成熟肽基因，经过凝胶电泳鉴定与试剂盒回收后，通过连接反应将目的片段连入表达载体中，即构建成含有斜带石斑鱼促性腺激素GTHα或FSHβ成熟肽基因的克隆载体。

本发明提供的一种克隆载体，优选为由含有斜带石斑鱼促性腺激素GTHα或FSHβ的成熟肽基因和大肠杆菌构建制得pPTZ 57R/T-GTHα或pPTZ 57R/T-FSHβ。