[发明专利]一种烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺

说明书

技术领域

本发明提供一种烟叶烘烤用改善烟叶工业可用性品质的微生物制剂生产工艺，属于微生物制剂生产工艺技术领域。

背景技术

微生物的发酵工艺通常包括菌种、培养基组成、发酵过程控制和后处理过程。目前，几乎所有微生物制剂的深层液体制备工艺都包括菌种制备、培养基组成、发酵过程控制工艺和后处理工艺。而后处理工艺不可避免地带来昂贵的设备投入、巨大的能耗和发酵液形成的污染源。

目前国内对枯草芽孢杆菌的液体发酵进行了一些研究，郝林华等(2006)报道了枯草芽孢杆菌液体发酵条件；沈智华等(2005)报道了枯草芽孢杆菌B115的优化培养条件；张丽霞等(2006)报道了枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化；钱风光等报道了生防菌枯草芽孢杆菌BS25在3L发酵罐中的发酵工艺优化(2009)。

例如：中国专利(200510126210.6)一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的同步发酵方法本发明涉及一种用于微生物肥料的芽孢杆菌液的同步发酵方法，其为在发酵罐生产过程中，将菌种的芽孢种子液，在种子罐上直接进行高温接种和高温处理。本发明的方法可分别使成熟芽孢的同步形成率达到90～99％，一般可缩短发酵周期6个小时左右。该方法克服了现有的微生物发酵方法接种的种子液易造成生长起点不一，菌体生长快慢参差不齐，几代同堂，给生产控制带来困难，且芽孢形成率低的缺陷，并可在大规模的液体发酵条件下，使之同步形成芽孢，并能提高芽孢形成的数量和比例，缩短生产周期的同步发酵方法。

发明内容

本发明先直接用重量百分比W/W为10％±5％纯烟叶浸提的固体培养基，在50℃-60℃培养温度下，分离筛选得到烟叶中本身自带的、具有活性的高温菌株——YN104、YN105、YN91，YN113、YN114菌株，然后再使用该菌种生产微生物制剂。

本发明烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺是：先直接用重量百分比W/W为10％±5％纯烟叶浸提的固体培养基，在50℃-60℃培养温度下，分离筛选得到烟叶中本身自带的、具有活性的高温菌株——YN113、YN105、YN104、YN91，YN114菌株，然后再使用菌该菌生产微生物制剂，具体步骤是：

A、将充分浸泡3-5天废弃烟叶液作为烟叶浸提原液，以体积比计，烟叶浸提原液/自来水按5％-15％的量(V/V)与琼脂(2.5g/100mL)混合，不另添加任何附加成分和调节pH值，在0.11-0.13MPa下25-35分钟高压灭菌后，倒双层平皿，制得纯烟叶浸提液固体平板；

按常规将烟叶样品梯度稀释后，取0.2mL放入纯烟叶浸提液固体平板中，涂布均匀后置50℃-60℃恒温箱培养至菌落出现，分离后得到在高温50℃-60℃还具有生理活性的烟叶表面微生物菌株，制剂生产工艺的菌种；

B、采用上述A步骤分离出的高温芽孢杆菌菌种，按体积比例，用3-5％的接种量接种于在含8±5％(重量/体积)经粉碎处理的废弃烟叶和92±95％自来水，经121-126℃、0.11-0.13MPa下灭菌25-35分钟的发酵培养基中，搅拌速度120-130rpm，维持培养温度在45-55℃，发酵时间40-48h；在发酵结束前2h，按发酵液重量百分比比例，加入0.1％过滤除菌的硫酸锰，继续搅拌至发酵结束；发酵液放罐直接分装容器，密封；即为提供烟叶烘烤用的微生物制剂。

所述工艺生产菌种是分离的高温菌菌种，其接种量为3-5％。

培养基成分为8±5％经粉碎处理的废弃烟叶和92±95％的自来水，不调节pH值。

发酵结束前2-4h，加入0.1-0.5％经过滤除菌的硫酸锰，继续搅拌至发酵结束，发酵液放罐时直接分装入容器，密封保存。

发酵液即为提供烟叶烘烤用改善烟叶工业可用性品质的微生物制剂。

本发明使用烟叶烘烤用微生物制剂成品时，用清水稀释1倍后喷施，不同生产菌株生产的菌剂可按等体积混合后加水使用，喷施用量：10000mL/亩。

本发明分离的高温菌生产菌株(高温芽孢杆菌)，在8±5％经粉碎处理的废弃烟叶低营养培养基中，经46h发酵后处以贫营养状态，并在发酵结束前2-4h添加少量硫酸锰促使菌体生成芽孢(休眠体)，芽孢具有非常强的抵抗恶劣环境的能力。因此，制剂产品在贫营养条件下，非常容易在普通常温环境下长期贮存。通过控制发酵培养基营养成分很容易做到在发酵结束时使培养液呈贫营养状态，再通过添加少量硫酸锰工艺措施，促使发酵液中的菌体在产品保存阶段由菌体状态生成芽孢状态。因此，省去投资和耗能量大、容易形成污染源的后处理工艺。所以本发明生产烟叶烘烤用微生物制剂工艺非常简便易行。