[发明专利]一种产抗真菌蛋白菌株的筛选方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株产抗真菌蛋白的菌株，命名为Aspergillus giganteus AF-11，已于2010年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.4342。同时涉及获得该菌的诱变筛选方法和利用该菌株发酵抗真菌蛋白并在啤酒大麦制麦中的应用的方法，属于微生物制麦技术领域。 

背景技术

AFP(antifungal protein)是由Aspergillus giganteus分泌的小分子量碱性蛋白，可有效抑制丝状真菌的生长，尤其是动植物致病真菌。近几年的研究发现AFP对抑制丝状真菌具有安全、高效、广谱、稳定的特点，而这些显著的特点使其最有希望成为新的抗真菌抗生素、安全的天然食品防腐剂、可靠的生物农药和基因工程目的基因载体。1965年，Olson等从美国密歇根州农场土壤中分离筛选得到的一株Aspergillus giganteus菌株并发酵液中分离得到一种由51个氨基酸组成的小分子碱性蛋白——AFP(抗真菌蛋白)，并证明对丝状真菌具有明显的抑制作用。研究还发现AFP可高效抑制许多人类和动植物致病霉菌，而对细菌和酵母菌无抑制作用，这种选择性抑制作用在医学和应用生物技术上引起了人们的广泛兴趣和高度关注。2006年，Szappanos等研究分析了AFP对哺乳动物细胞功能的影响，通过实验发现AFP对哺乳动物细胞无细胞毒素效应和免疫反应，并认为AFP是具有很好应用前景和开发研究价值的新的抗真菌抗生素。 

目前，啤酒大麦在制麦过程由于潮湿的环境容易污染镰刀霉、烟曲霉和根霉等真菌。这些受污染的麦芽不但影响酿造性能还影响食品安全，目前一般采用制麦过程中加入石灰水来抑制菌的污染，但是这样也会带来食品安全的隐患。利用微生物自身产生的抗真菌蛋白来抑制污染很少有报道，尤其是关于Aspergillus giganteus的研究更是几乎没有看到。 

发明内容

本发明的目的是提供一株能广谱抗真菌的高产AFP菌株及其筛选方法。同时利用该菌株发酵生产AFP的方法在制麦过程中进行有害微生物控制。本发明的目的可以通过以下措施达到： 

1、土壤样品取样及前处理：取碱性土壤2g，用水浴、乙醇和蛋白胨处理。 

2、真菌培养：在28℃，筛选培养基(葡萄糖10g，NH₄NO₃1g/L，酵母膏1g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，孟加拉红0.006g/L，链霉素0.003g/L，琼脂20g/L。)培养4-5天后，挑选可以抑制其它霉菌生长的菌株。 

3、驯化诱变：30℃条件下，将筛选的菌株YPD培养基上驯化培养4-5天，然后经EMS 诱变，挑选抑菌圈较大的菌株作为复筛菌株。 

4、摇瓶复筛：摇瓶发酵，采用纸片法或者牛津杯法检测发酵液菌株抑菌圈大小。 

5、选出抑菌能力最强的菌株，发酵生产AFP，用考马斯亮蓝比色法测定AFP含量。 

6、将AFP用于啤酒大麦的制麦过程中，抑制菌的污染。 

本发明取得以下优点和显著进步： 

1、得到了一株高产抗真菌蛋白的菌株，保藏号为CGMCC NO.4342。 

2、将该菌株发酵生产AFP用于啤酒大麦的制麦过程中，抑制菌的污染，减少了食品加工过程中化学试剂石灰水的加入，用生物的手段更加安全环保的解决了制麦污染问题。 

具体实施方式

实施例1产抗真菌蛋白菌株的筛选 

1、1.5g土样加入10ml无菌生理盐水，在60℃条件下，水浴30min 

2、去除无菌水，加入65％乙醇处理10min，加入0.1％浓度的蛋白胨溶液处理10min。 

3、将0.1ml溶液接种到肌氨酸蔗糖培养基，25℃条件下，培养7天。 

4、挑选不同形态特征的单菌落，转接到MEA(蔗糖25g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸氢二钾0.6g/L，氯化钾0.4g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.08g/L，琼脂20g/L)斜面固体培养基上。 

5、用10％甘油收集并保藏单菌落的孢子。 

6、分离的单菌落在MEA培养基pH4.525℃条件下培养4天。 

7、打孔器挖取直径25mm的菌苔，移至已灭菌的培养皿中，每皿三块。