[发明专利]一种产抗真菌蛋白菌株的筛选方法及应用

权利要求书

1.一种抗真菌蛋白生产菌株，其分类命名为Aspergillus giganteus AF-11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO 4342。鉴定其为巨大曲霉的一个亚种，与一般巨大曲霉存在形态上存在明显差异，具体表现为分生孢子囊短而小，长度约为一般巨大曲霉的2/3；体积同样比一般巨大曲霉小；分生孢子梗比一般巨大曲霉短。

2.如权利要求1所述一种抗真菌蛋白生产菌的选育方法，包括以下步骤：

(1)土样处理：将土样进行水浴，乙醇，蛋白胨选择性富集处理。

(2)真菌培养：经富集处理的样品28℃条件下，在筛选培养基上培养4-5天

(3)菌种筛选：挑选可以抑制其他霉菌生长的菌落。

(4)菌种驯化：30℃在YPD培养基上驯化培养4-5次。

(5)诱变筛选：经EMS诱变，挑选抑菌圈较大的菌株，作为复筛菌株。

(6)菌种复筛：摇瓶发酵，检测发酵液的对靶标菌抑菌圈大小。

(7)培养优化：温度，碳源，氮源，检测抗真菌蛋白(AFP)产量和效价。

3.如权利要求2所述(1)中土样处理方法，其处理步骤为：

(1)采集土壤样品，烘干，4℃冰箱保存。

(2)取2g土壤样品研碎，匀质，加入10mL无菌生理盐水，混匀，50℃条件下水浴45min。

(3)去除生理水，加入5mL65％乙醇处理10min。

(4)将处理的样品加入0.1％浓度的蛋白胨溶液处理10min。

4.如权利要求2所述(2)中所用筛选培养基组成如下：

葡萄糖10g，NH₄NO₃1g/L，酵母膏1g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，

孟加拉红0.006g/L，链霉素0.003g/L，琼脂20g/L。

5.一种通过权利要求1所述菌种发酵生产AFP的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：

(1)斜面培养：菌种在28℃条件下，培养4～5天，待孢子成熟后，用无菌水洗脱孢子，制成孢子悬液用于种子培养。

(2)种子培养：种子培养基灭菌后，冷却后按5％～10％的接种量，置于30℃、转速为150～220rpm的摇床上。培养48～60小时后的菌株用于发酵培养基接种。

(3)发酵培养：摇瓶发酵培养：发酵培养基灭菌后，冷却后按照10～25％的接种量接入种子培养的菌株，置于32℃、转速为150～220rpm的摇床上，发酵培养72～96小时后，分离提取AFP。

6.如权利要求5所述的方法(1)中斜面培养基组成如下：

蔗糖20～30g/L，硝酸钠1～2g/L，磷酸氢二钾0.5～1g/L，氯化钾0.2～0.5g/L，硫酸镁0.2～0.5g/L，硫酸亚铁0.005～0.01g/L，琼脂20g/L。

发酵培养基：牛肉膏10～15g/L蛋白胨15～20g/L玉米淀粉10～20g/L NaCl 5～10g/L

7.如权利要求5所述的方法(2)种子培养基组成如下：

葡萄糖12～15g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母浸膏2g～5/L，NaCl 6～10g/L。

8.权利要求1-7所述菌种和筛选方法和抗真菌蛋白(AFP)的发酵生产用于啤酒大麦制麦的用途。