[发明专利]一种高产β-葡萄糖苷酶产香酵母及在无醇苹果饮料的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产香酵母及其筛选方法，命名为Brettanomyces sp.已于2010年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.4343，属于微生物技术领域，还涉及到采用该酵母发酵酿制增香型无醇苹果饮料的方法，属于发酵饮料领域。 

背景技术

随着社会的不断进步和人们物质上的不断充裕，人们的消费理念有了新的变化，更加注重自身的健康，对饮料的品质有了更高的要求，既要天然有营养，又要爽口，有杀口力和刺激感，色、香、味俱佳。目前无醇及低醇饮料(Low-and non-alcohol beverage)越来越受到人们的关注，此类饮料是一种低浓度酒精饮料。而采用发酵技术将微生物发酵苹果汁酿制而成的饮料称为无醇及低醇苹果饮料，目前我国的苹果产量居于世界第一，仅仅食用或生产苹果汁其产值不高，因此采用发酵技术来酿制的增香型苹果饮料无疑将会大大提升产业的附加值。目前很多关于苹果酒的报道都是利用酿酒酵母直接发酵成苹果酒，含有的乙醇含量比较高，不利于健康的需要。也有的苹果饮料是添加各种增酸剂，香精等勾兑而成，不是真正的苹果发酵低醇饮料。本研究的产香酵母只进行微量的产香发酵，即产生很多乙酸乙酯，乙酸异戊酯等香气物质，很少进行酒精发酵，因此它保留了苹果汁原有营养的同时，运用微生物发酵生成特殊的发酵风味，并将乙醇含量控制在较低水平，它既赋予了饮品特有的发酵风味，又充分利用了水果的营养和药理价值，经常饮用有益于人体健康。 

发明内容

本发明的内容是提出一种产香酵母及利用该酵母发酵酿制增香型无醇苹果饮料的方法。产香酵母是从酿酒企业的废酒液经自然存放后分离筛选得到的，产酯产香较为突出，酒精产量低于0.5％的标准，且非常适合发酵苹果汁酿造增香型无醇苹果饮料。用该酵母酿造无醇苹果饮料的方法采用以浓缩苹果汁为原料，以产香酵母为发酵酵母的酿造工艺，工艺中运用低温长时酿造、膜过滤处理及抗氧化褐变等技术。 

本发明内容包括： 

1、一株高产β-葡萄糖苷酶的产香酵母，本酵母是从酿酒企业的废酒液中经培养、筛选分离纯化后成为纯培养物，可产生高活性的β-葡萄糖苷酶，主要用于发酵无醇苹果汁并增加无醇苹果饮料的香气。 

产香酵母的特征：细胞多为椭圆形，直径5-10微米，长宽比为1-1.5，芽殖；在产酶培养基中产β-葡萄糖苷酶的活性达到11.46U/ml；在发酵培养基中发酵4天后酒精度低于0.5％， 具有稳定的发酵性能，发酵苹果汁的香气更浓郁。相对于酿酒酵母，其产酒精能力很低，产香非常突出，且发酵性能稳定，是酿制无醇饮料的优质酵母。 

产香酵母从酿酒企业中的废酒液中培养、经过筛选分离成为纯培养物的方法是：A、筛选酵母时所使用的培养基为： 

(1)初筛培养基：用于筛选高产β-葡萄糖苷酶的酵母，葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，青霉素0.01％，七叶苷0.3％，氯化铁0.05％，琼脂2％，蒸馏水1000mL，121℃下灭菌20min； 

(2)产酶培养基：用于复筛产酶以测定酶活，葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，蒸馏水1000mL，121℃下灭菌20min； 

(3)麦汁培养基：麦芽汁10Bx，琼脂2％，pH6.4，121℃下灭菌20min； 

将存放长时间的废酒液以无菌水稀释成10^-1至10^-6不同的梯度，涂布在初筛培养基上，于28℃下培养3天，挑取平板上周围呈黑色的菌落为产β-葡萄糖苷酶的菌株，分别将每株菌划线分离纯化得到纯菌落。将纯菌落接一环到麦芽汁斜面培养基上28℃培养3天后4℃保存。将初筛所得菌株在产酶培养基中28℃下摇床培养2-3天，通过p-NPG比色法测β-葡萄糖苷酶酶活得到酶活最高的菌株。 

2、一种发酵增香型低醇或无醇苹果饮料的制备方法，其特征为以浓缩苹果汁为原料，以产香酵母为发酵增香的酿造工艺，工艺流程为浓缩果汁的稀释、产香酵母发酵、饮料的过滤及澄清、成品无醇苹果饮料。其方法有如下特点： 

A、浓缩苹果汁经稀释8至10倍后添加抗坏血酸0.8％、亚硫酸氢钠0.6％进行护色，以防止在发酵过程中褐变。 

B、发酵温度控制在16-18℃下纯种低温发酵，发酵16-20天，无菌状态接种。 

C、将发酵后的饮料添加壳聚糖进行澄清及过滤、最后经孔径为0.45μm的膜过滤掉绝大部分微生物。