[发明专利]治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法及应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程生物技术领域，具体涉及治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法及应用。

背景技术

肿瘤基因治疗能够在基因水平根本上弥补肿瘤发生发展过程产生的基因表达异常状况、纠正肿瘤的失调状态，因而具有广阔的应用前景。但是肿瘤基因治疗仍存在一些瓶颈环节的难题，例如，在系统给药情况下如何使被转入的治疗基因实现只限制在实体瘤内部或者整个肿瘤环境内高水平、高特异性地表达，而不在其它正常组织表达，从而有效消除或降低治疗基因可能带来的副作用？这一技术难题限制了基因治疗在实体瘤治疗中的实际应用。在开发适用于癌症基因治疗的载体的研发过程中，基因治疗载体的安全性和有效性都是极其重要的因素。很多实体瘤，包括大多数乳腺癌和黑色素瘤等原发瘤，都具有特征性的缺氧区或坏死区[Patyar S等，2010，Journal of Biomedical Science 17：21；Li X等，2003，CancerGene Therapy 10：105-111]。肿瘤患者体内的组织氧浓度分析结果表明，肿瘤内的的氧分压为10-30mm汞柱，而在正常组织中的氧分压则达24-66mm汞柱。而实体瘤中的缺氧坏死区的细胞对于放疗和化疗均不敏感，所以经典的放化疗不足以完全杀死肿瘤细胞，从而导致肿瘤病人对放化疗的耐受、也造成肿瘤的复发和转移[Li X等，2003，Cancer Gene Therapy 10：105-111；Lee CH等，2005，MolecularTherapy 11：707-716]。

根据这一实际情况，在针对实体瘤的基因治疗研究领域，开发靶向于实体瘤内部缺氧坏死区的基因运载表达体系成为了近年的研究重点。一些厌氧或兼性厌氧细菌如：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，梭状芽孢杆菌(generaClostridium)和双歧杆菌(Bifidobacterium)，可以在系统性感染后，选择性地在实体瘤内缺氧区定殖生长[Patyar S等，2010，Journal of Biomedical Science 17：21；Li X等，2003，Cancer Gene Therapy 10：105-111]，与此同时它们还能刺激机体产生免疫抗肿瘤效应[Lee CH等，2009，Journal of Immunotherapy 32：376-388；ChenG等，2009，Cancer Science 100：2437-2443；Avogadri F等，2005，Cancer Research65：3920-3927；Liu T等，2010，Cancer Gene Therapy 17：97-108；Eisenstein TK等，2001，Microbes and Infection 3：1223-1231]。近年来，科学家们已经利用鼠伤寒沙门氏菌作为基因治疗的肿瘤靶向性载体进行了一系列工作，并且取得了可喜的效果。在这些研究工作中，研究人员对于如何使抗肿瘤的治疗基因进行表达开展了一系列尝试，他们或者尝试了一些原核生物的启动子，比如阿拉伯糖诱导启动子、外膜孔蛋白C(ompC)启动子，或者采用了真核细胞组成型启动子如：β-actin启动子，或者真核细胞中的辐射诱导启动子等，它们都表现出了较显著的抑制肿瘤生长作用[Ganai S等，2009，British Journal of Cancer 101：1683-1691；Brader P等，2008，Clinical Cancer Research 14：2295-2302；Weth R等，2001，Cancer GeneTherapy 8：599-611；Loessner H等，2007，Cellular Microbiology 9：1529-1537；Nguyen VH等，2010，Cancer Research 70：18-23；Loeffler M等，2007，Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America104：12879-12883；Loeffler M等，2008，Journal of the National Cancer Institute100：1113-1116；Loeffler M等，2008，Cancer Gene Therapy 15：787-794；Loeffler M等，2009，Cancer Immunology Immunotherapy 58：769-775；Lee CH等，2004，Journalof Gene Medicine 6：1382-1393；Lee CH等，2005，Cancer Gene Therapy 12：175-184；King I等，2002，Human Gene Therapy 13：1225-1233；Li YH等，2001，InternationalJournal of Cancer 94：438-443]。然而，在上述基因治疗表达体系中依然存在一些问题：如，(1)基因表达的质粒载体在体内的稳定性较差、容易丢失；(2)尽管肿瘤组织靶向性细菌在肿瘤组织中高度富集，具有较好的肿瘤靶向性，但是这并不表明它们在其它正常组织中不分布或者不存在，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)就在肝脏和脾脏中存在，因此，治疗基因会在正常组织中进行表达，导致治疗基因非肿瘤组织特异性的表达，从而产生体内毒性；(3)在绝大多数的以往研究中，治疗基因在体内表达水平较低、无法利用常规的蛋白电泳和蛋白质印迹(Western blot)方法进行目标治疗基因的表达检测[Weth R等，2001，Cancer Gene Therapy 8：599-611；Li YH等，2001，International Journal ofCancer 94：438-443；Pawelek JM等，1997，Cancer Research 57：4537-4544；Liu SC等，2002，Gene Therapy 9：291-306；Nemunaitis J等，2003，Cancer Gene Therapy10：737-744]。