[发明专利]一种鉴别建鲤的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别建鲤的分子标记方法。

背景技术

目前在鲤生产中种质混杂现象比较严重，如何从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。建鲤是我国养殖鲤中比较广泛的鱼类，但是其种质混杂现象比较严重，包括苗种场、养殖场等诸多环节。若要从现有情况中进行品种的鉴定和分离，将有助于解决种质混杂现象、混杂品种多、混杂品种退化等问题，因此，从较为简单的2品种混杂着手，寻找种质鉴别、分离的方法称为解决种质混杂问题的一条有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别建鲤的分子标记方法，有助于解决鲤种质混杂现象、混杂品种多、混杂品种退化等问题，可从混杂的鲤种质中鉴别、分离种质；操作简单，易于掌握，准确性高。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种鉴别建鲤的分子标记方法，包括以下步骤：

1）选择建鲤自交F1代、黄河鲤父本和建鲤母本的杂交F1代混合群体为研究对象，随机选择48尾，分别采样血液，采用DNA提取法分别提取DNA样本；

2）采用IGF2a基因内含子2进行PCR扩增，模板为通过步骤1）所提取的混合群体的DNA样本；

在进行PCR扩增时，PCR 反应体系为 25uL，包括 10×buffer 15uL，Mg2+（25m mol/L）1uL，dNTPs（各 2mmol/L）1uL，上下游引物（10mmol/L）各1uL模板DNA 1uL，TaqDNA聚合酶（Promega）1U，dd H₂O扩增反应均在PCR仪上完成；

PCR 反应条件如下：

（1）94℃预变性3 min；

（2）94℃变性20s；

（3）退火温度56度20s；

（4）72℃延伸30s；

（5）步骤（2）-（4）重复33次；

（6）72 ℃延伸10min；

（7）将经过步骤（6）反应后的 PCR 产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合goldview显色进行检测；

3）通过步骤2）扩增出的PCR产物经电泳检测为693bp后，进行测序，获得所扩增的核苷酸序列；

4）通过步骤3）获得核苷酸序列以后，根据给定对照的野生型碱基C和突变型碱基CA的结果进行序列比对，并判断比对结果：

（a）获得的核苷酸序列为野生型碱基C，则获得的核苷酸为来自建鲤的概率为67.6%；

（b）获得的核苷酸序列为突变型碱基CA，则获得的核苷酸为来自正交个体的概率为100%。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供一种能从建鲤、黄河鲤和建鲤正交F1代混合群体中分离种质的方法；从测序结果中，与对照组比较，如果是野生型，为建鲤的概率为67.6%，如果是突变型是黄河鲤和建鲤正交后代的概率为100%。

2、本发明可提供一种进行河流种质混杂治理的参考路径；按照鲤的自然寿命计算为8～10年，那就是说如果一条河流养殖以建鲤养殖为主，而后放入黄河鲤父本作为获取较大杂种优势的途径，那么要区分出建鲤，只需要检测野生型即可；要区分杂种一代，那么检测出的突变型全部为杂种鲤。

3、本发明提供繁育改良的避免种质混杂的一种方法；实际生产中，通过杂交改良获取杂种优势时，只需要提供改良品种的父本或母本即可，这样避免了被引入品种造成的种质混杂现象，对于引入品种需在苗种场保种即可。

具体实施方式

本发明所述的一种鉴别建鲤的分子标记方法，包括以下步骤：

1）选择建鲤自交F1代、黄河鲤父本和建鲤母本的杂交F1代混合群体为研究对象，随机选择48尾，分别采样血液，采用DNA提取法分别提取DNA样本；

2）采用IGF2a基因内含子2进行PCR扩增，模板为通过步骤1）所提取的混合群体的DNA样本；

在进行PCR扩增时，PCR 反应体系为25uL，包括10×buffer 15uL，Mg2+（25m mol/L）1uL，dNTPs（各 2mmol/L）1uL，上下游引物（10 mmol/L）各1uL模板DNA 1uL，TaqDNA聚合酶（Promega）1U，dd H₂O扩增反应均在PCR仪上完成；

PCR 反应条件如下：

（1）94℃预变性3 min；

（2）94℃变性20s；

（3）退火温度56度20s；

（4）72℃延伸30s；

（5）步骤（2）-（4）重复33次；

（6）72℃ 延伸10min ；