[发明专利]酵母细胞中硒化镉量子点提取、纯化方法

说明书

技术领域

     本发明属于微生物学、生物化学、纳米科学技术领域，更具体涉及一种酿酒酵母细胞内合成的硒化镉量子点的提取、纯化方法，适用于其他微生物细胞内合成的其他类型量子点或其他纳米材料的分离制备。

背景技术

   量子点是最近几年发展起来的一种新型纳米材料，其合成一直采用金属化合物-元素有机合成法、水相无机合成法等经典的化学方法，合成出来就是比较纯的量子点。1989年在Nature上最早报道了可以在微生物中合成硫化镉量子点，此后生物合成量子点发展迅速，不同类型的量子点也相继在细胞中合成出来。

   生物合成量子点的方法相对传统化学合成法优势明显，但唯一限制因素是在细胞内合成的量子点不容易被有效地提取出来。量子点不像磁小体一样可以利用磁力来和细胞组分分离。细胞内合成的量子点被生物大分子包裹和修饰，量子点的稳定性依赖于这些生物大分子的稳定，一旦这些包裹或在量子点外修饰的生物大分子被破坏，那么细胞内合成的量子点也就不复存在了。因此如何在保证量子点稳定性、天然结构不被破坏的前提下，有效“温柔”地将细胞内合成的量子点提取并纯化出来，是当前量子点生物合成领域面临的一大挑战。

酵母菌是一类具有细胞壁的真核微生物，本实验室2009年发表于Advanced Functional Materials的论文（2009, 19: 2359-2364）中,报道了利用酵母菌成功在活细胞内合成硒化镉量子点，并进行了初步的量子点提取制备。由于酵母细胞壁较为坚韧，量子点提取制备条件必须较为温和，否则荧光损失较大。传统的破除细胞壁的方法诸如：反复冻融、高压匀质、微波法等方法，对酵母细胞壁破碎效果不佳，而更为剧烈的方法如：碱裂解法又会破坏细胞内量子点。因此必须发展一种条件温和、细胞破碎程度高，又不影响量子点荧光性质，且能保持量子点稳定性的酵母细胞裂解方法。

  除了细胞壁裂解的技术问题外，对细胞内合成的量子点提取另一限制因素是量子点与细胞结构的分离。细胞内合成的量子点与细胞器结合紧密，即便细胞被破坏它们也牢固地结合在细胞器或细胞碎片上。一套成熟的细胞内合成的量子点提取、纯化方案不仅是进一步发展生物合成量子点这一绿色、环境友好的方法，对量子点的应用及生物合成量子点机理的研究也具有重要意义。

发明内容

   本发明的目的是在于提供了一种微生物细胞内合成的量子点的方法，主要是利用生物化学的方法来提取并纯化酵母细胞内合成的硒化镉量子点。本分离纯化方法操作简便，提取率高，产物稳定，重要的是实验安全，不涉及任何有毒或有危险的试剂，在一般生物学实验室均可以完成。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种酵母细胞内合成的硒化镉量子点的提取、纯化方法，其步骤是： 

1）酵母细胞壁的裂解：取已合成硒化镉量子点的酵母细胞培养液40-60 mL[酵母细胞内量子点合成方法参见本实验室2009年发表于Advanced Functional Materials的论文（2009, 19: 2359-2364）]，4000 g离心1-3 min，收集细胞沉淀，重悬于细胞裂解缓冲液（Lysis buffer）中，按4000 U/10¹⁰细胞的量加入细胞溶解酶（Lyticase），30℃摇床，100 r/min振荡孵育4-6 h至溶液变透明为止；

2）酵母细胞的破碎：10000 g离心9-11 min，收集1）步骤处理过的细胞，重悬于适量（24-36 mL）细胞裂解缓冲液（Lysis buffer） 中，加入蛋白酶抑制剂（Cocktail）；400 W（工作2 s，间歇2 s，200次；每20次停10 s）超声波处理裂解细胞；

3）硒化镉量子点的粗分离：将2）步骤处理过的样品于4000 g离心9-11 min，吸取含量子点的黄色上清，将含量子点的粗提物与细胞碎片初步分离；

4）硒化镉量子点的细分离：向3）步骤中离心收集的黄色上清中加入十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度为2%，轻轻摇匀，室温（20-25℃以下相同）静置9-11 min，10000 g离心28-32 min，取上清用0.22 mm滤膜过滤，然后用50 K MWCO超滤管进行超滤、水洗；

5）硒化镉量的纯化：将4）步骤中获得的样品进行聚蔗糖400（Ficoll 400）密度梯度离心，113000 g离心3-5 h，小心取出密度梯度离心后的黄色分层；50 K MWCO超滤管进行超滤、水洗，即得到纯化的硒化镉量子点。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：