[发明专利]高产DL-3-苯乳酸乳酸菌菌株的筛选方法

说明书

技术领域：

本发明属分析化学及应用微生物学领域，具体涉及通过应用HPLC测定MRS发酵上清中苯乳酸含量(phenyllactic acid，PLA)，从而筛选高产苯乳酸乳酸菌菌株的方法。

背景技术：

近年来，化学防腐剂和兽药残留已日益危害人类及动物的健康，广谱、高效、稳定、安全的新型抗菌物质的开发与研究已成为当务之急。乳酸菌是人体及动物肠道内的正常菌群，亦是公认安全(GRAS，Generally Recognized As Safe)的食品级微生物(Food-grade Microorganisms)。乳酸菌在食品发酵过程中不仅赋予发酵食品特有的风味、质地和结构，而且还能产生多种可以有效抑制食源性致病微生物的生长与繁殖的细菌素(bacteriocin)、环二肽(cyclic dipeptides)、有机酸(organic acid)、过氧化氢(hydrogen peroxid)、双乙酞(diacetyl)等抑菌因子，基于乳酸菌的安全性和在食品工业中的重要地位，以乳酸菌及其代谢产物开发新型生物防腐剂已成为生物保藏(biopreservation)领域的研究重点和热点。

DL-3苯乳酸(DL-3-phenyllactic acid，PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸是近年来发现的可以由部分乳酸菌分泌产生的一种新型生物防腐剂，有D-苯乳酸和L-苯乳酸两种对应异构体。它能够较好地抑制多种引起食物腐败的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和产生霉菌毒素的真菌。苯乳酸具有安全、无毒，在低浓度下不影响食品的风味与口感、作为新型饲料添加剂具有提高禽畜免疫力和肉质等优点。此外，DL-3苯乳酸还是丹参素(β-3，4-二羟基苯基乳酸钠)的衍生物之一，具有与丹参素类似的药理作用，能够抑制血小板聚集、抑制血栓形成及改善微循环，对缺血性心脏病具有一定的药用价值。随着我国对食品安全的日益重视，DL-3苯乳酸的开发和利用具有广泛的应用前景。

目前已知的能够分泌产生苯乳酸的乳酸菌菌株产量较低，以MRS(De Man-Rogosa-Sharpe broth)为培养基，在没有经过任何条件优化的情况下最高产量为99mg/L，严重限制了DL-3苯乳酸的生物合成和应用，因此高产该有机酸菌株的筛选势在必行。然而筛选方法必需建立在一种简便、快速且同时能定性及定量的检测方法基础上。目前苯乳酸的检测方法主要有薄层层析、高分辨气质联用、液质联用和高效液相色谱法。薄层层析只能定性和半定量检测苯乳酸，高分辨气质联用和液质联用具有高通量、自动化程度和分辨率高等优点，但价格高昂，不适合常规实验室进行普筛；而已知的苯乳酸的HPLC检测方法需要诸如液液萃取、固液萃取和pH调节等复杂的样品前处理，完成一个样品检测至少需要2-3小时，不能适应快速分析检测的需要。MRS培养基(DeMan-Rogosa-Sharpe broth)是乳酸菌的选择性培养基，也是乳酸菌开展相关科学研究的首选培养基。因此，建立从MRS发酵液中检测苯DL-3苯乳酸的快速简便方法，对于高产DL-3苯乳酸乳酸菌菌株的快速筛选及定性与定量检测具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是应用HPLC对乳酸菌MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸进行定性与定量测定后，建立一种快速而简便的高产苯乳酸乳酸菌菌株的筛选体系。

本发明的上述目的，是通过下面的技术方案得以实现的：

DL-3-苯乳酸乳酸菌菌株的筛选方法，包括培养基的配置与样品前处理、HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量进行定性、定量检测。

所说培养上清的配制采用乳酸菌MRS发酵液4℃，6000rpm离心10min，取上清液过0.45μm滤膜为乳酸菌MRS发酵上清。

所说样品前处理为配置DL-3-苯乳酸标准贮备液和工作液：准确称取(100±0.01)mg DL-3-苯乳酸标准品，用甲醇溶解定容至100mL，即为1g/LDL-3-苯乳酸标准贮备液，于-4℃保存；吸取DL-3-苯乳酸标准贮备液，以甲醇为溶剂定容，配制浓度为0、60、100、200、400、600、800mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液。

所说用PLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量定性检测是采用反相离子抑制技术，在流动相中加人0.5％磷酸V/V，抑制DL-3-苯乳酸解离，利用Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，使DL-3-苯乳酸与乳酸菌MRS发酵上清液中杂质分离，通过对比标样与乳酸菌MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸的保留时间及光谱图进行DL-3-苯乳酸定性检测。