[发明专利]一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法。

背景技术

近年来，生物技术尤其是基因工程的迅猛发展，表达蛋白已变得较容易。相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作。蛋白质分子大规模分离纯化是当前生物工程中的关键技术问题，纯化过程所需成本约占总成本的60％-70％。兴起于20世纪末的融合标签技术促进了重组蛋白纯化技术的发展，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3′端或5′端融合某种标签的编码基因，通过宿主表达重组蛋白质，该重组蛋白可通过其融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而得以纯化。此方法已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。它无需了解蛋白质的生化特性或生理活性，就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化蛋白。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件，已成功地通过一步亲和层析从粗提物中纯化出了多种重组蛋白，纯度达90％以上。其中最为典型的代表就是聚组氨酸(以镍离子为配基)，此法具有快速、高分辨率等诸多优点。

融合表达在最初的检测和纯化时会很方便，但若对目标蛋白进行生化及功能分析，需要避免亲和标签所带来的潜在干扰，通常必需去掉外源融合标签，尤其是具有治疗和诊断用途的蛋白，往往必需去掉所有外源氨基酸。已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。早期的化学裂解法虽便宜、有效，但由于裂解位点特异性低和可能对目标蛋白产生不必要修饰，已被酶解法逐步取代。酶解法条件较温和，且普遍用于此用途的 蛋白酶都具有高度特异性，它们均具有较长的底物识别序列，降低了蛋白质中其它无关部位发生断裂的可能性。但酶解法成本高(这些酶价格一般都相当昂贵)、反应时间长(10多个小时)、更重要的是这些酶蛋白不可避免地混入目标蛋白中，造成新的污染，需在裂解后附加层析分离除去，使纯化工艺复杂化。此外，与融合标签结合的特异配基价格昂贵也限制了在大规模分离纯化中的应用。因此，发展简单易行、廉价、可靠的蛋白质纯化方法对于大规模生产重组蛋白及高通量蛋白质组学研究具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法。本发明制备的融合标签蛋白能快速与目标蛋白融合，经过条件的控制，可采用离心或过滤的方法分离重组蛋白，效果显著；蛋白表达条件简单，易于操作，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。

为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案：

一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一种。(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCCNO.4185，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期：2010年9月17日。)

一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的编码基因，它具有序列表2所示的核苷酸序列。(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC NO.4185，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期：2010年9月17日。)

一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，采用序列表2所示核苷酸序列的编码基因融合表达之后经高速离心进行分离制备该融合标签蛋白。

所述的序列表2所示的编码基因插入到经人工改造后的表达载体pET-22b(购于上海捷瑞生物工程有限公司)，转化到大肠杆菌BL21(DE3)或者BLR菌株中，用热击法转化到大肠杆菌BL21(DE3)或者大肠杆菌BLR菌 株中(二者均为商业化菌株，可直接从上海超研生物科技有限公司、上海博亚生物科技有限公司购买)。BL21(DE3)基因型：F_omp T hsdSB(rB_mB_)dcm gal(DE3)pLysS Cam r，特点：该菌株带有质粒pLysS，具有氯霉素抗性。大肠杆菌BLR菌株为BL21(DE3)的衍生株，它是recA-，RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它的缺失，可以保证质粒的稳定。质粒中含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。