[发明专利]一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法

权利要求书

1.一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白，其特征在于：它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一种；该氨基酸序列由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.4185，保藏日期：2010年9月17日。

2.一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的编码基因，其特征在于：它具有序列表2所示的核苷酸序列；该核苷酸序列由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.4185，保藏日期：2010年9月17日。

3.一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于：采用序列表2所示核苷酸序列的编码基因融合表达之后经高速离心进行分离制备该融合标签蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于：所述的序列表2所示的编码基因插入到经人工改造后的表达载体pET-22b，转化到大肠杆菌BL21(DE3)或者BLR菌株中，经过质粒酶切分析、PCR鉴定，筛选出阳性转化子，阳性转化子经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导使编码基因获得融合高效表达，细胞破碎后，利用高速离心对表达的蛋白进行纯化。

5.根据权利要求4所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于：所述的表达载体pET-22b的人工改造包括如下步骤：1)人工合成序列表3的基因片段；2)用上述基因片段替换初始pET-22b(+)中NdeI与EcoRI酶切位点之间的序列。

6.根据权利要求4所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于所述的高效表达为低温诱导表达，包括如下步骤：1)将甘油菌按1∶100的体积比接入到含100mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基液体中培养，4℃保存，离心收集细胞；2)将细胞重悬浮于2ml含100mg/L氨苄青霉素2ml的LB液体中，再培养，以此接种；按1∶100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床，以200r/min的速度，培养4-5小时；加入终浓度为1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂，诱导7小时；之后，4℃下以4000r/min的速度，离心15分钟，按照1L菌液40mlPBS缓冲液重悬菌体。

7.根据权利要求4所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于所述的细胞破碎采用超声波法，包括如下步骤：1)取出加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂，诱导7小时后的锥形瓶，冰浴，使细胞停止生长，将菌液分装于100ml离心管中，使处于对称位置的离心管质量相等，离心，离心条件转速PBS缓冲溶液∶菌液4000r/min，时间15min；2)离心机停止后，取离心管，弃上清，按PBS缓冲溶液∶菌液＝1∶25的体积比加入PBS缓冲溶液洗涤菌体，在旋涡混合器上充分振荡，直至将离心管底的菌体冲洗干净，收集；3)用超声波破碎机进行细胞破碎，条件为超2s，停2s，80个循环，之后收集细胞破碎液。

8.根据权利要求4所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于所述的纯化采用高速离心法纯化蛋白，包括如下步骤：1)加入终浓度为0.5％W/V聚乙烯亚胺，振荡，使其充分混匀，去除核酸；2)将蛋白质溶液分装于10ml的离心管，冰浴15min，离心，其条件为4℃，14000r/min，离心时间15min；3)取出离心管，将上清液移到干净的离心管，弃沉淀，按NaCl溶液∶上清液＝1∶2的体积比加入NaCl溶液，45℃恒温水浴15min，离心，离心条件为38℃，13500r/min，时间为5min；4)取出离心管，迅速弃上清，每管加2mlPBS缓冲溶液，沿管壁缓慢滴加，使壁上的蛋白质充分溶解，冰浴15min后离心，离心条件为4℃，14000r/min，时间为5min；5)重复步骤3)和4)一次。最终弃沉淀，收集上清，保存在-20℃冰箱中；6)透析后冷冻干燥。