[发明专利]一种多肽免疫试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测多肽标志物抗原的多肽免疫检测试剂盒，其特征在于，包括血清多肽抗体和缓冲液，所述抗体固定在固相载体上，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒。

2.根据权利要求1所述的多肽免疫检测试剂盒，其特征在于，所述血清多肽抗体为抗合成肽5抗体，所述合成多肽5的全长序列为：Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。

3.根据权利要求2所述的多肽免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抗合成肽5抗体按照如下步骤制备：

1)采用偶联载体蛋白KLH的合成多肽5作为免疫原免疫BALB/C小鼠；

2)2-3周后检测尾血滴度，取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG作用下进行融合；

3)通过ELISA方法进行筛选，用有限稀释法对分泌抗体阳性的杂交瘤细胞进行克隆纯化；

4)选出针对偶联载体蛋白KLH的多肽杂交瘤细胞，扩增细胞系，制备并纯化单抗腹水，检测单抗的滴度、特异性、敏感性及亚型鉴定，得到抗合成肽5抗体。

4.权利要求1-3任一项所述的多肽免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将纯化后的所述血清多肽抗体与所述固相载体按比例混合，所得浓度为0.15μg/μL-1.5μg/μL，在4℃旋转孵育15分钟-2小时，放置1-5min沉淀，过滤，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液100-200μL清洗所述固相载体2-5次，得到所述多肽免疫检测试剂盒。

5.一种多肽免疫质谱检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：用权利要求1-3任一项所述的试剂盒从血清样品中分离多肽标志物抗原，用高通量的MALDI-TOF MS检测洗脱液中的所述多肽标志物抗原，由此建立完整的多肽免疫质谱检测方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离方法为将所述试剂盒中的抗体与血清样品中的多肽标志物抗原发生特异性结合，用洗脱液从所述固相载体上分离出所述多肽标志物抗原。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述血清多肽抗体为抗合成肽5抗体，所述多肽标志物抗原为合成肽5，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取15-25μl固相载体，置于Eppendorf管中，加入1.56μg-31.1μg抗体，4℃旋转混合15分钟-2小时，放置1-5min，移出上清液，用0.01M、pH7.4PBS缓冲液100-200μL清洗所得固相载体沉淀2-5次；

2)取0.48μg-24μg多肽标准品、10-50μL PBS，与步骤1)清洗后的所述固相载体混合，4℃旋转混合8-12h；

3)放置1-5min，移出上清液，用100-200μL PBS清洗沉淀2-5次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；

4)加入5-10μL洗脱液，吸排混合1-5min；

5)离心，取上清液，用MALDI-TOF-MS检测，得到多肽标准品质谱；

6)用40-60μl血清样品替代步骤2)的多肽标准品，重复步骤2)-5)，用MALDI-TOF-MS检测，测定血清样品中的多肽标志物抗原。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为pH2.7的0.1mol/l甘氨酸-HCl溶液，优选地为5％乙酸，更优选地为含0.1％TFA的50％ACN的混合液，更优选地为含0.1％TFA的70％ACN的混合液。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤5)所述检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N₂激光器，激光波长337nm，能量2000，离子延迟提取时间390ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用peptide II standard kit离子峰校正，质量扫描范围500-5000Da。