[发明专利]哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物细胞染色体标本的制备方法，具体涉及一种哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法。

背景技术

在新药研发、保健品评价和辐射安全研究中，哺乳动物细胞染色体畸变观察是遗传学毒性评价中重要的内容。在染色体畸变评价中，染色体中期相标本制备是非常关键的环节，染色体分散的好坏对实验质量具有重要的意义，进而影响评价的可靠性。分散不足的中期染色体之间易于交叉、重叠，导致在分析染色单体及染色体的断裂、缺失以及互换时，难以做出准确判断。如何获得形态良好的中期染色体，一直是许多新药安全性评价遗传实验室面临的难题。

实际工作中发现标本制备过程中染色体分散易受外界环境影响，由于没有统一的标准，致使各实验室染色体中期相标本质量不同，不同实验室之间结果的可比性差。温度和湿度对染色体滴片后的展开的影响是显而易见的。在滴片过程中，染色体依靠吸收外界水分迅速铺散，因此外环境的湿度是非常关键的因素。由于温度会对滴片的干燥时间产生影响，所以也在一定程度上影响到分散效果。由于我国幅员辽阔，一年四季气候条件差异显著，各地试验室温度、湿度等相差很大，单单凭借外部自然环境，难以达到染色体制备时的适宜条件，也就难以保证评价体系的稳定。因此，通过相关措施创造一个相对稳定的局部环境，对制备良好标本是很有帮助的。通过对外部环境的优化控制将显著降低人为因素的影响，保证了染色体中期相制备的可靠及稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法，以得到中期染色体质量、形态和分散度良好、易于进行染色体评价的染色体中期相标本。

本发明的技术方案如下：

一种哺乳动物细胞染色体中期相标本的制备方法，该制备方法包括以下步骤：在20～30℃的温度和45～50％的相对湿度下将哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片上。优选地，在25℃的温度和50％的相对湿度下将哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片上。

在上述制备方法中，优选地，哺乳动物细胞悬浮液滴加高度为距载玻片15～25cm，优选20cm。优选地，哺乳动物细胞悬浮液滴加时，载玻片与水平面成15°角。优选地，哺乳动物细胞悬浮液的滴加量为每载玻片10μL。

在上述制备方法中，哺乳动物细胞悬浮液的制备方法可以包括以下步骤：

(1)将培养至指数生长期的哺乳动物细胞用秋水仙素处理；

(2)以体积比为甲醇∶冰醋酸＝3∶1的固定液固定哺乳动物细胞。

具体而言，上述哺乳动物细胞悬浮液的制备方法包括以下步骤：

(1)将培养至指数生长期的哺乳动物细胞用0.25％(g/100ml)胰蛋白酶水溶液消化制得每毫升包含3～5×10⁴个细胞的细胞悬浮液，并培养21小时；

(2)加秋水仙素处理24小时，秋水仙素的浓度为每毫升细胞悬浮液15μg确认；

(3)弃去培养基，用0.25％(g/100ml)胰蛋白酶水溶液消化哺乳动物细胞并离心，优选在1000rpm下离心10分钟；

(4)弃去上清，加入0.075mol/L的KCl水溶液37℃下静置20分钟；

(5)再加入体积比为甲醇∶冰醋酸＝3∶1的固定液，吹打细胞混匀后离心，优选在1000rpm下离心10分钟；

(6)弃去上清，再加入体积比为甲醇∶冰醋酸＝3∶1的固定液，37℃下静置20分钟后离心。优选地，步骤(6)反复进行3次。

在上述制备方法，优选地，哺乳动物细胞悬浮液滴加到载玻片后自然干燥，再用10％(1份姬姆萨原液∶9份缓冲液)姬姆萨染液染色。

本发明还提供了根据上述制备方法制备的哺乳动物细胞染色体中期相标本。

以下是本发明的详细描述：

1.细胞准备：

复苏哺乳动物细胞，获取足量所需细胞，加入适量培养基，培养至指数生长期。

用0.25％(g/100ml)的胰蛋白酶水溶液消化传代细胞，制备成3～5×10⁴细胞/mL细胞悬液，培养21小时，加入秋水仙素(浓度15μg/mL细胞悬液)，培养至24小时倒掉培养基，收获细胞。

2.细胞固定：

用0.25％(g/100ml)的胰蛋白酶水溶液消化细胞后，移至15mL离心管，1000rpm离心10分钟，弃去上清液。