[发明专利]从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及一种从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法。

(二)背景技术

间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。间充质干细胞不仅具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力，还具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，动物实验和初步的临床研究已显示间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制的作用，所以间充质干细胞可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、支持造血和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。然而就目前已比较成熟的骨髓间充质干细胞而言，其含量非常低，仅占骨髓中单核细胞的1/10⁵～10⁶，并且采集骨髓给患者带来极大的痛苦，取材不方便，所以这就迫切需要寻找一种取材简单且间充质干细胞丰富的源组织。目前的研究表明脂肪组织中含有能分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的前体细胞群，具有较强的增殖能力和多分化潜能，可称之为脂肪基质细胞或脂肪间充质干细胞。与骨髓相比，脂肪组织可通过腹部的吸脂术获得，对患者损伤较小，获取相对容易，更重要的是脂肪间充质干细胞不易受到肿瘤细胞污染，更容易进行体外净化，病人可以用自体细胞，并且移植细胞更易被患者自身组织所接受，更快的整合到自身组织系统以发挥作用，避免了一系列的伦理问题和异体细胞的免疫排斥等移植副反应。

目前从脂肪中提取脂肪间充质干细胞一般步骤包括麻醉抽脂获取大量的人体脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行扩增培养，其中所述体外培养体系中含有胎牛血清；并且抽脂过程中需要大面积的局部麻醉，并在抽脂部位切一个口，对病人造成了一定的创伤和痛苦，为了获得大量的脂肪组织，需要大面积的抽脂手术，导致患者抽脂面积较大，手术时间较长，出血较多或导致发热现象，如果后期护理不好容易引发炎症。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种减少病人痛苦、满足临床安全应用的从微量热脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种从微量人脂肪组织提取间充质干细胞的方法，主要包括如下步骤：

(1)微创抽脂，注射利多卡因小面积的局部麻醉，利用微型吸引针无菌抽取患者微量脂肪组织；

(2)脂肪间充质干细胞的提取，采用磷酸盐缓冲液浸泡、离心洗涤无菌获取的脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行培养。

步骤(1)中，抽取的脂肪组织为5ml。

步骤(2)中，采用磷酸盐缓冲液浸泡，1500r/min离心洗涤脂肪至，用0.1％Ⅰ型胶原酶37℃水浴消化约30min，加磷酸缓冲液稀释胶原酶并离心，悬浮下层沉淀，100目滤网过滤，1500r/m离心10min，以去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，随后进行体外培养。

本发明间充质干细胞规模化培养的方法，主要包括如下步骤：

(1)原代培养，培养体系为STEMPRO MSC SFM无血清培养基，含有2mM/ml的谷氨酰胺和100U/ml的青-链霉素；

(2)细胞鉴定，流式检测细胞表面抗原CD44和CD34的表达，体外分化实验检测脂肪间充质干细胞多向分化潜能，包括像脂肪细胞的分化和成骨细胞的分化；

(3)规模化扩增，采用STEMPRO MSC SFM无血清培养体系，含有2mM/ml的谷氨酰胺、10ng/ml的血小板衍生生长因子、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子和0.5μg/ml的庆大霉素。

本发明有效减少了病人的痛苦，排除了非常瘦的患者无法获取脂肪组织的障碍，整个细胞培养体系中尽量避免了使用动物源制品，特别是没有血清制品，满足了将来临床安全应用的需求。

(四)附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为倒置相差显微镜下脂肪间充质干细胞的形态图；

图2为流式检测人脂肪间充质干细胞表面标志的表达示意图；

图3为培养的第三代细胞成脂和成骨诱导分化染色检测图。

(五)具体实施方式

实施例：

1.试剂