[发明专利]对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物基因测序分析技术领域，尤其涉及一种对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法。

背景技术

为了研究生物环境中微生物群体的种类，一般传统的方法包括：直接对微生物进行培养，变性梯度凝胶电泳(DGGE，Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)，末端限制性内切酶片段长度多态性(T-RFLP，Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)，荧光原位杂交(FISH，Fluorescence In Situ Hybridization)，对可能的微生物种类进行PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)；但这些方式都只能揭露环境中很小一部分微生物种类。如果能进行宏基因组的分析，通过直接对环境中的微生物群体进行基因组研究，得到一个比较全面的微生物种类目录，有助于对微生物群体的后续研究和应用。

由于原核生物中16S rRNA(核蛋白核糖核酸，ribosomal RNA(RiboNucleic Acid))的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系；16S rRNA的大小为1500bp(碱基对，Base Pair)左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元；所以在宏基因组的研究中，16S区测序是最常用的聚类和分类方法。传统的宏基因组的测序是通过Sanger技术测序16S rRNA gene(16S rDNA)得到至少500bp的读长，这个读长的长度足够长，能够装配出近乎完整的16S rDNA序列，帮助我们去精准地研究每一条序列的物种来源，但它容易产生嵌合体，而且测序成本比较高，费时又费力。

随着新开发出的测序技术以及测序成本的逐步降低，宏基因组的研究变得越来越实用，所涉及的技术包括Pyrosequencing、Solexa等。对于这些革命性的技术的一个主要挑战就是读长太短，无法对每个个体的16S rDNA进行测序，因而它的测序信息不足以让我们去精准地对微生物进行分类。

综上所述，提供一种更加准确地对微生物进行聚类分析的方法且方便快捷、成本低廉成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供一种对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法，通过对16S的高可变区V6区进行solexa测序，并通过对这些16S可变区的短序列进行系统分类，可以在成本低廉的基础上准确反映物种的丰度信息。

本发明的一个方面提供了一种对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法，该方法包括：提取微生物的脱氧核糖核酸DNA；通过引物对宏基因组16S核糖体脱氧核糖核酸rDNA的高可变区V6进行聚合酶链式反应PCR，并为每个样品加上标签序列；把不同样品的PCR产物进行混合；对混合后的PCR产物进行Solexa建库法建库；使用Solexa测序工具对高可变区V6的文库进行双末端pair-end测序，得到原始的测序数据；对测序数据进行筛选，以过滤掉低质量的数据；利用重叠群的关系对高可变区V6的全长序列进行组装；通过标签序列把reads分配到对应的样品上；通过对reads进行分类分析，以实现使用高可变区的测序对微生物群体进行高通量的分类。

本发明提供的对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法的一个实施例中，该方法还包括：在步骤“提取微生物的脱氧核糖核酸DNA”之前，执行微生物群体的取样。

本发明提供的对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法的一个实施例中，该方法还包括：在步骤“通过对reads进行分类分析”之后，对不同差异度的序列进行操作分类学单元OTU的分类；根据标签序列和reads，进行种群多样性估计Chao1算法和血管紧张素转化酶ACE的多样性分析。

本发明提供的对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法的一个实施例中，在进行种群多样性估计Chao1算法和血管紧张素转化酶ACE的多样性分析之后，输出微生物群体的多样性分析图和相对丰度图。