[发明专利]对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法

权利要求书

1.一种对宏基因组16S高可变区V6进行测序聚类分析的方法，其特征在于，所述方法包括：

提取微生物的脱氧核糖核酸DNA；

通过引物对宏基因组16S核糖体脱氧核糖核酸rDNA的高可变区V6进行聚合酶链式反应PCR，并为每个样品加上标签序列；

把不同样品的PCR产物进行混合；

对混合后的PCR产物进行Solexa建库法建库；

使用Solexa测序工具对所述高可变区V6的文库进行双末端pair-end测序，得到原始的测序数据；

对所述测序数据进行筛选，以过滤掉低质量的数据；

利用重叠群的关系对所述高可变区V6的全长序列进行组装；

通过标签序列把reads分配到对应的样品上；

通过对所述reads进行分类分析，以实现使用所述高可变区的测序对微生物群体进行高通量的分类。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤“提取微生物的脱氧核糖核酸DNA”之前，执行微生物群体的取样。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤“通过对所述reads进行分类分析”之后，对不同差异度的序列进行操作分类学单元OTU的分类；

根据所述标签序列和reads，进行种群多样性估计Chao1算法和血管紧张素转化酶ACE的多样性分析。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在进行种群多样性估计Chao1算法和血管紧张素转化酶ACE的多样性分析之后，输出微生物群体的多样性分析图和相对丰度图。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤“通过引物对宏基因组16S核糖体脱氧核糖核酸rDNA的高可变区V6进行聚合酶链式反应PCR，并为每个样品加上标签序列”进一步包括：

使用引物967f：CNACGCGAAGAACCTTANC和1406R：GACAGCCATGCANCACCT去复制微生物群体中细菌的16S高可变区V6区片段；

对每个微生物样品加标签序列，所述标签序列被加到所述引物967f的5’端的前面，以及在所述标签序列和所述引物967f之间加上碱基GT。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

对于古生菌的高可变区V6的聚合酶链式反应PCR，使用引物958AR：AATTGGANTCAACGCCGG和1048AR：CGRCGGCCATGCACCWC。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤“把不同样品的PCR产物进行混合”进一步包括：

对所述16S的高可变区V6的PCR产物进行浓度定量；以及按照等摩尔的量混合在一起。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤“对混合后的PCR产物进行Solexa建库法建库”进一步包括：

把混合产物进行纯化，末端修复，在3’端加上碱基A，加上双末端Pair-end测序接头；

加完接头后，对样品进行纯化；

对纯化后的样品进行溶解，并作为模板进行聚合酶链式反应PCR扩增；以及

对所述聚合酶链式反应PCR产物进行胶纯化。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低质量的数据包括：与最邻近的引物不匹配的序列、小于50碱基对的序列，或者具有至少一个不同碱基的序列。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤“利用重叠群的关系对所述高可变区V6的全长序列进行组装”进一步包括：

采用所述高可变区V6的PCR产物5’端的前75、70、65、60和55碱基对来进行重叠从而组装；其中，组装的标准是一对序列具有大于5碱基对的重叠长度和在重叠区域小于10％的不匹配度。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤“通过对所述reads进行分类分析”进一步包括：

将分配到对应样品上的所述reads比对到现有16s v6数据库中，来达到使用高可变区的标签测序对微生物群体进行高通量的分类分析，进而研究微生物群体的结构。