[发明专利]用于马鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于马鹿茸真伪鉴别的特异性寡核苷酸引物及探针，用于鉴别马鹿茸真伪的实时荧光PCR检测方法，以及所述特异性寡核苷酸引物和探针或试剂盒在鉴别马鹿茸真伪中的应用。

背景技术

鹿茸(Cornu Cervi Pantotrichum)是鹿科动物梅花鹿(Cervus nippon Temminck)或马鹿(Cervus elaphus Linnaeus)雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，习称花鹿茸、马鹿茸。鹿茸始载于《神农本草经》，列为中品，具有壮肾阳、益精血、强筋骨等功效，是我国名贵的动物药之一。现市售种类规格较多，由于原动物不同，分花鹿茸和马鹿茸两种；由于采收方法不同，又分砍茸、锯茸和鹿茸片三种；由于叉枝多少及老嫩不同，又分为鞍子、二杠、三岔、莲花等多种。

鹿的种类甚多，但有药用价值的主要指梅花鹿和马鹿。马鹿是仅次于驼鹿的大型鹿类，因为体形似骏马而得名。马鹿的种类主要有挪威马鹿、巴巴里马鹿、科西嘉马鹿、西非马鹿、中欧马鹿、苏格兰马鹿、西班牙马鹿、东欧马鹿、大夏马鹿、塔里木马鹿、克什米尔马鹿、西藏马鹿、白臂鹿。

由于马鹿价格昂贵，一些不法分子采用以假乱真的手段谋取暴利，不仅危害了消费者的利益，而且对构建和谐的市场秩序造成了严重的影响。市场上常有伪品制成的切片出售。主要为美洲鹿亚科的狍(Capreolus capreolus)、驯鹿(Alces alces)、驯鹿(Rangifer tarandus)等角以及其他动物的骨块或动物胶用动物皮包埋后切制成的伪品。

为了维护消费者的利益以及良好的市场秩序，国内外许多学者研究了多种方法对鹿茸的真伪进行鉴别。常用的方法有性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱法鉴别、光谱法鉴别、紫外光谱法鉴别等。但是传统的检测方法易受不同品种及产地的鹿茸中所含有的化学成分的影响，由于现在的掺伪水平和手段越来越高明，掺伪成分越来越复杂，严重限制了传统的检测方法应用空间。

分子生物学技术以其方便、准确、迅速、简洁的特点，已成为近年来国内外学者研究的热点，其为证明食品的真伪提供了真实、可靠的依据，给食品种类鉴别、产品溯源等食品鉴伪研究注入了新鲜血液。但是，截至目前，分子生物学技术在中药材马鹿茸鉴伪方面的应用尚处于初步研究阶段。

目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地鉴别中药材马鹿茸的方法。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的中药材马鹿茸的真伪鉴别方法，进行中药材马鹿茸真伪的鉴别。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供快速鉴别马鹿茸的特异性寡核苷酸引物及探针。

本发明的另一个目的在于，提供快速鉴别马鹿茸真伪的实时荧光PCR检测方法。

本发明的再一个目的在于，提供用于快速鉴别马鹿茸真伪的试剂盒。

本发明的再一个目的在于，提供本发明的特异性寡核苷酸引物和探针在鉴别马鹿茸真伪中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于马鹿茸真伪鉴别的特异性寡核苷酸引物对和探针。本发明以马鹿的DNA为检测基础，根据线粒体DNA(mtDNA)D-环(Displancement loop，D-Loop)区序列在不同鹿科物种中具有差异性的特点，克隆了马鹿线粒体DNA D-环区序列。根据这些序列设计引物及探针，利用实时荧光PCR法检测样品中的马鹿茸成分。

本发明的寡核苷酸引物对和探针是根据不同鹿科物种的线粒体DNAD-环区具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为Marlu-F：AACACGTGATATAACCTTATGCGC(SEQ ID No.1)，所述下游引物为Marlu-R：TATGTCCTATACACTAACTCATGTGC(SEQ ID No.2)；所述探针为Marlu-P：TGTGCTAGAACACGCATGTATAACAGCAC(SEQ ID No.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。使用本发明的引物对和探针的组合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。