[发明专利]脂质体包裹重组人睫状神经营养因子

说明书

技术领域

本发明涉及一种含重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)脂质体的制备方法，脂质体配方和用途。

背景技术

睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF)最初从鸡胚的眼组织睫状节中提取出来，因对睫状神经元有营养作用并可维持鸡副交感神经节的存活而得名。经研究发现，CNTF具有多种功能，在神经系统，肌肉系统，肥胖症及其相关疾病的治疗中具有重要意义，有广阔的临床开发前景。但由于血脑屏障的阻隔，CNTF到达中枢神经系统受限，妨碍了CNTF用于帕金森氏症、老年痴呆症等疾病的治疗，通过脂质体复合制剂可以帮助药物分子穿越血脑屏障，为CNTF在中枢神经系统中用药提供了可行的途径。因天然序列的CNTF蛋白毒副作用较大，其临床应用受到影响。为寻找安全有效的CNTF，人们已研究出多种CNTF的突变体。Regeneron制药公司发表了用于治疗肥胖症的CNTF的人工合成类似物Axokine(AX15)。AX15是人CNTF的一个三重突变体：17位的Cys被Ala替换，63位的Gln被Arg替换，并缺失了C末端的15个氨基酸。与天然人CNTF相比，AX15具有更高的生物学活性，更好的稳定性和可溶性。中国药品生物制品检定所发明了一种重组睫状神经营养因子突变体(中国专利，200510097985.5，公开日：2006年4月19日)，突变体的第17位Cys突变为Ser，并去掉C端的16个氨基酸，该突变体在治疗肥胖症或与肥胖症相关的疾病及神经损伤相关疾病方面有较好效果。兰州生物制品研究所发明了一种重组睫状神经营养因子突变体(中国专利，200710112387.X，公开日：2008年3月19日)，将天然人CNTF基因的17位Cys突变为Ala，63位Gln突变为Arg，在治疗普通肥胖症或糖尿病型肥胖症方面有较好效果。

已知CNTF能微量进入血脑屏障，作用于下丘脑食欲调节中枢，激活度素样通路，起到降低体重的作用。另外，有研究表明，玻璃体腔内直接注射CNTF能促进损伤的视网膜神经节细胞(retinal ganglinecells，RGC)RGC存活和视神经再生。Weise(Neurobiol Dis，2000，7：212-223)等利用基因治疗的手段，用腺病毒(adenoviral vector，Ad)作为CNTF基因载体注入鼠玻璃体内，可使CNTF mRNA和蛋白稳定表达，至少持续18天，起到有效治疗神经萎缩等病变的作用。然而天然或重组的人CNTF经皮下或静脉给药后不能由血液循环有效穿越血脑屏障，实现治疗中枢神经相关病变的功效。本发明提供了rhCNTF(A¹⁷R⁶³15)脂质体的制备工艺及其进入脑组织中的情况，可实现人CNTF有效穿越血脑屏障。本发明以Axokine(AX15)的cDNA为基础，在基因序列上设计了带有Nde I酶切位点和ATG翻译起始密码子，下游引物则带有BamHI酶切位点和TAA终止密码子，全部使用大肠杆菌偏爱密码子，命名为rhCNTF(A¹⁷R⁶³15)(Recombinant Human CNTF，rhCNTF)。采用表达载体质粒pET-3c，重组表达并经高效纯化工艺获得具有生物活性的rhCNTF，将其成功地用于含CNTF的脂质体制备研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能穿越血脑屏障的含rhCNTF的脂质体，从而改善神经元损伤和退行性病变相关的疾病，如帕金森氏症、老年痴呆症、脊髓侧索硬化症(ALS)等的治疗效果。

为实现上述目的，本发明以Axokine(AX15)的cDNA为基础(将野生型人CNTF的cDNA C端去掉15个氨基酸，增加其生物活性，同时将17位Cys突变为Ala，63位Gln突变为Arg)，在基因序列上设计了带有酶切位点和ATG翻译起始密码子，下游引物则带有酶切位点和TAA终止密码子，全部使用大肠杆菌偏爱密码子，命名为rhCNTF(A¹⁷R⁶³15)。经人工全基因合成后用Nde I和BamHI双酶切后，与Nde I和BamHI双酶切的pET-3c大片段在T4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌DH5α。将鉴定后含AX15的外源基因的重组质粒转化BL₂₁(DE₃)plysS，诱导筛选高效表达的工程菌。rhCNTF(A¹⁷R⁶³15)的纯化工艺包括包涵体处理、复性及重组蛋白纯化过程。