[发明专利]一种超分辨荧光寿命成像方法及成像系统

说明书

技术领域

本发明属于光学、生物学、化学领域，尤其涉及一种超分辨荧光寿命成像方法及成像系统。

背景技术

荧光显微技术具有无损、非接触、高特异性、高灵敏、高活体友好以及能够提供功能信息等突出优点，一直是生命科学，尤其是细胞生物学研究的重要工具。近年来，随着生命科学的发展，对荧光显微技术也提出了越来越高的要求，激光技术、荧光探针标记技术、新型荧光探测技术和成像手段的不断发展，极大地促进了荧光显微技术的发展，成为推动生命科学发展的重要动力。此外，荧光显微技术也在成像的对比机制方面获得了很大的进展。

目前，生命科学的研究已进入分子层次，为了更好地理解生命活动和疾病发展的分子机理，需要在分子水平上研究细胞内蛋白质位置与功能的关系以及蛋白质分子之间相互作用等，这对荧光显微技术提出了更高的要求。突破衍射极限限制，发展具有纳米空间分辨的远场荧光显微技术已成为国际显微成像领域的前沿热点之一。超分辨(SR)成像技术的发展，也为荧光寿命成像(FLIM)的新发展提供了巨大的机遇。研究和发展超分辨荧光寿命成像(SR-FLIM)技术，可以显著提高FLIM荧光寿命的测量精度以及定位精度，利用基于SR-FLIM的荧光共振能量转移(FRET)，可以在分子尺度研究蛋白质分子之间的相互作用，获得分子之间相互作用的效率及其精确定位。

然而，受光学衍射极限的限制，荧光显微技术的空间分辨率只能达到200纳米左右，难以满足生命科学研究的需要。而对于荧光寿命成像来说，其空间分辨率受衍射极限的影响尤为严重。传统的衍射受限FLIM图像中各个像素的荧光寿命值，并不能反映其所对应的分子的荧光寿命，无法做到分子尺度的荧光寿命成像。

超分辨荧光寿命成像是一个新兴的研究领域，寻求具有高度原创性的技术原理与方案，并率先解决超分辨荧光寿命成像在生命科学应用中存在的难题，具有重大的科学意义与应用价值。

发明内容

本发明提供了一种超分辨荧光寿命成像方法，旨在突破光学衍射极限限制，实现超分辨荧光寿命成像。

本发明是这样实现的，一种超分辨荧光寿命成像方法，所述方法包括下述步骤：

对标记于样品中的光开关染料分子进行稀疏激活；

激发样品中被激活的光开关染料分子，收集被激发的光开关染料分子所发射的光子并记录光开关染料分子的荧光图像，对荧光图像中的光开关染料分子进行质心定位；

对在质心定位处接收到的光子进行计数，确定被激发的光开关染料分子的荧光寿命；

结合得到的光开关染料分子的质心定位结果和荧光寿命，构建超分辨荧光寿命图像。

本发明还提供了一种用于实现如上所述的超分辨荧光寿命成像方法的成像系统，包括：

第一激光器，用于实现对标记于样品中的光开关染料分子的稀疏激活；

第二激光器，用于激发样品中被激活的光开关染料分子；

合束镜，用于将所述第一激光器所发出的光和所述第二激光器所发出的光合成为一束光；所述第一激光器所发出的光由所述合束镜的第一反射面呈一定入射角射入，并在第一反射面反射；所述第二激光器所发出的光由所述合束镜的第二反射面射入，经所述合束镜透射后由所述合束镜的第一反射面射出；

依次设于所述第一激光器和所述合束镜之间的第一透镜、第一滤光片、反射镜；

依次设于所述第二激光器和所述合束镜之间的第二透镜、第二滤光片、扫描振镜；

第一物镜、第二物镜；

依次设于所述合束镜的第一反射面与所述第一物镜的之间的第一管镜、双色镜；

时间相关单光子计数器，用于对接收到的光子进行计数；

依次设于所述双色镜与所述时间相关单光子计数器之间的第一发射滤光片、第二管镜、光电倍增管；

电子倍增型CCD摄相机，用于记录光开关染料分子的荧光图像；

设于所述第二物镜与所述电子倍增型CCD摄相机之间的第二发射滤光片、第三管镜；

主机，同时连接所述时间相关单光子计数器和所述电子倍增型CCD摄相机，用于结合所述电子倍增型CCD摄相机记录的光开关染料分子的荧光图像，对荧光图像中的光开关染料分子进行质心定位，并根据所述时间相关单光子计数器在质心定位处对接收到的光子进行计数的结果，构建超分辨荧光寿命图像；同时还连接所述第一激光器和所述第二激光器，用于控制所述第一激光器和所述第二激光器的工作；

以及

延迟器，连接于所述主机和所述电子倍增型CCD摄相机之间，用于实现所述第二激光器和所述电子倍增型CCD摄相机的同步。