[发明专利]荧光PCR法对食品中葡萄球菌肠毒素的快速检测与分型方法

说明书

技术领域

本发明属于食品科学与技术中的微生物毒素的分子检测领域，具体涉及应用荧光定量PCR法对食品中葡萄球菌肠毒素的11种血清型基因进行快速高通量检测与分型方法及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, 金葡菌)是最常见的食源性致病菌之一，其不仅导致大量的食物中毒与化脓性感染病例，并可造成爆发性流行。金葡菌的毒力因子包括入侵时产生的多种蛋白，如耐热核酸酶、透明质酸酶、脂肪酶、溶血素及肠毒素等。其中，葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal Enterotoxin, SE）是引起人类食物中毒和感染性休克的关键致病因子，其本质是与抗原递呈细胞的主要组织相容性复合物II（MHCII）通过T细胞受体结合的超级抗原，结合后导致T细胞大量增殖及细胞因子释放，从而引起呕吐与中毒性休克等症状。在不考虑仅能引起中毒性休克而不能引起食物中毒的类肠毒素（SEL）的前提下，葡萄球菌肠毒素分为11种血清型，除上世纪六十年代确认的五种（SEA、SEB、SEC、SED、SEE）外，近年又陆续发现了6种，包括SEG、SHE、SEI、SER、SES、SET。

近年来的研究表明，不同的葡萄球菌肠毒素血清型在宿主类别、致病能力、分布情况、时序性表达等方面均具有很大的差异，流行病学调查也证明了不同的金葡菌性食物中毒爆发流行是由于不同类别的肠毒素血清型而引起的。如2009年末，法国就爆发了大规模的肠毒素E导致的食物中毒。目前在欧美发达国家，对金葡菌性食物中毒的风险评价和诊断已精确到肠毒素血清型的水平。因此，对食品中金葡菌肠毒素血清型的鉴定与分型具有重要的现实意义，分型方法的准确性、灵敏度、速度与通量均对食品安全检测与预警的水平具有显著的决定性影响。

目前在我国，对食品中葡萄球菌肠毒素检测与分型的方法主要有两种：免疫法与PCR法。免疫法以酶联免疫分析法与VIDAS法为代表，每次只能特异性检测1种或几种肠毒素，且完全不能对多种肠毒素血清型进行区分；现有的PCR法均采用针对不同肠毒素血清型的特异性引物进行PCR扩增，并进行电泳检测，通过区分条带分子量大小对肠毒素进行分型。如申请号为200910071033.4的发明专利“葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法及基因分型的检测方法”即采用上述方法，其弊端包括：检测时间长，PCR扩增加电泳检测须花费3小时以上；检测通量小，每次电泳检测最多只能检测十几个样品中的一种肠毒素或一个样品中的十几种肠毒素；电泳检测使用的荧光染料对操作者健康危害极大；未对可导致食物中毒的11种肠毒素进行专门区分，而将肠毒素与类肠毒素混为一谈等等。

在上述的研究背景下，建立以荧光定量PCR的自动检测技术为基础的食品中11种可导致食物中毒的肠毒素血清型的快速高通量分型方法，将对食品安全的快速评价和风险预测具有重要的实践意义。

发明内容

本发明需要解决的问题包括：首先，对于各类金黄色葡萄球菌血浆凝固酶呈阳性的食品样本，在无菌状态下提取其中的总DNA成分，解决提取的效率与纯度问题；然后，根据Genbank数据库中已发表的不同肠毒素血清型基因sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、ser、ses、set的特征序列设计特异性引物，针对上述提取的总DNA，使用ABI 7500 FAST荧光定量PCR仪的快速模式进行这11种葡萄球菌肠毒素基因的SYBR Green荧光定量PCR检测与分型，并应用VIDAS酶联荧光自动分析仪对含有sea、seb、sec、sed、see的样品进行方法学验证，从而为各类食品的金葡菌性食物中毒风险提供评价依据。

本发明中，我们为食品中的重要致病因子葡萄球菌肠毒素的分型提供了一种高效、快速、简便、灵敏的SYBR Green荧光定量PCR方法，该方法与原有方法相比，在检测速度、检测通量、灵敏度、安全性等方面均具有显著的创新性优势，为食品中致病菌毒素污染的控制和评价探索了新的途径。