[发明专利]离子束辅助脉冲电泳的玉米转基因技术

说明书

技术领域

本发明是生物技术领域的一种玉米转基因方法，尤其涉及一种以玉米成熟种子为材料，进行离子束辅助脉冲电泳的玉米转基因方法。

背景技术

玉米是是我国和世界主要的农作物之一，玉米的生产对于世界和我国的粮食问题具有重要的意义。随着世界人口的增长和环境的恶化，育种工作者遇到了前所未有的挑战，而常规育种又有着育种进程慢、遗传资源匮乏等缺点。因此，开展玉米转基因育种技术研究势在必行。目前，玉米转基因技术中已发展了多种转化方法，而以农杆菌介导法和基因枪法最为成熟。尽管如此，这两种方法仍有很大的缺陷，例如：农杆菌介导法对玉米基因型要求严格，不同基因型之间转化效率表现差异较大，再生时间长以及玉米幼胚作为该方法的最为常用外植体受到季节生长的限制，严重影响转化效率；基因枪法又有着转化频率低、工作量大和耗材昂贵等缺点。因此，研究者一直致力于开发一种具有转化频率较高、不受生长季节和基因型限制等特点的转基因方法。

脉冲电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是Schwartz等人于1984年发明的一种全新的电泳技术，用于分离约10Mbp的DNA片段。其原理是在凝胶上外加正交电场，交替变化的电场能够使DNA分子重新定向在狭小的凝胶中不断向前运动而分离。利用脉冲电泳技术分离大片段的DNA分子原理为带壁的植物细胞进行外源基因导入目的受体提供了一种新思路。自从杨金水等人利用低压脉冲电泳对水稻愈伤组织进行转化获得成功后，在随后几年内，脉冲电泳作为一种新型的转基因方法逐渐受到研究者的重视并得到了很大的发展。目前，利用该技术虽有多个物种相继报道获得了成功，但该方法的缺点是转化频率低，转化频率不稳定。

造成这一缺点的原因主要有以下几个方面：

1.根据目前报道的研究，使用该技术必须对植物细胞进行处理，例如：水稻种子要诱导出愈伤组织，然后酶解细胞壁，释放出没有细胞壁的原生质体，才能实现转化的成功。而这种处理效率低，对外植体伤害大。

2.不同的物种间形成胚性愈伤组织的能力差异较大，表现最为明显的是玉米等单子叶植物胚性愈伤组织的诱导较为困难，因此会导致下一步的成苗率差、转化效率低等缺点。

3.使用的外源DNA本身没有穿透细胞膜的能力，主要依靠脉冲电流在处理材料的细胞膜上形成穿孔，外源DNA才能进入植物细胞，最终整合到基因组。选择合适的电泳时间及电压是外源DNA成功转移的首要条件，电泳时间过长对外植体影响较大，影响成苗率，电泳时间过短不能使外源DNA最大量的进入细胞内，降低转化效率；同样，电压小不足以使细胞膜形成穿孔，电压过大易使材料失去活性。

正是由于以上的各种原因，大大降低了脉冲电泳转基因的效率和不稳定性，严重制约着该技术的发展与应用，无法获得长足发展。

发明内容

本发明提供一种基于提高脉冲电泳转化效率和稳定性为目的，以离子束辅助脉冲电泳转化玉米种子并直接成苗的转基因方法。该方法以成熟的玉米种子为材料，对种子进行N离子进行注射处理后，进行脉冲电泳转基因，并获得转基因玉米，该方法为玉米的遗传转化提供了一种新方法，为玉米的转基因育种奠定了基础。

本方法主要通过以下技术方案实现：一种离子束辅助脉冲电泳的玉米转基因技术，对成熟的玉米种子进行N离子注射后，将其置于特制的琼脂糖凝胶胶块中进行脉冲电泳，然后培养成苗的一种玉米转基因技术。

具体包括如下步骤：

(1)选取成熟饱满的玉米种子，在0.1％的HgCl₂中进行消毒15min，然后用无菌水冲洗3-5次，剥去种胚周围种皮；将消毒并剥皮的种子分单层、均匀排布在培养皿内，种胚朝向束流方向，进行N离子注射处理；

(2)将处理后的种子置于包埋胶中，制作支持胶，然后将包埋玉米种子的包埋胶放入支持胶上，放入电泳槽，将要转化的外源基因样品注入支持胶起始位置的样孔内，开始电泳；

(3)电泳结束后，将玉米种子放入MS培养基上成苗，然后移到大田，待3-4叶期进行除草剂抗性筛选和PCR检测。通过对后代植株进行除草剂抗性筛选及PCR检测，表明外源基因已经成功的导入受体，获得了玉米转基因植株。

作为本发明的优选技术方案，进行N离子注射处理时，剂量为2×10¹⁶N⁺/cm²。

作为本发明的另一优选方案，电泳时间为120min。

与已有技术相比，本发明的优点体现在：