[发明专利]一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无浆体病原的试剂中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种根据羊无浆体(Anaplasma ovis)主要表面蛋白4(MSP4)基 因序列，检测羊无浆体病原的环介导的恒温扩增技术(LAMP)。

背景技术

羊无浆体病是绵羊和山羊红细胞内专性寄生的由节肢动物传播的立克氏体 疾病。该病在我国的西北地区大量的分布，对养羊业的发展存在着一定的潜在 威胁。1912年Schellhase和Bevan报道在东非发现了寄生于绵羊、山羊的羊 无浆体病。羊无浆体的临床症状较为温和，发病动物常表现为轻微发烧，但对 山羊的致病性较强。在我国，自从马良玉(1982)和丁智彬(1985)分别发现 并报道了寄生于我国绵羊和山羊红细胞内的羊无浆体以来，只有吕文顺等在 1989-1990年间对该病进行了较为仔细的研究，确认了该病广泛分布于我国的大 西北，而在这些省份养羊业占据着十分重要的地位。宋步刚等(1989)报道， 内蒙的额济纳旗流行的羊无浆体病的发病率高达40％-50％，死亡率达17％， 危害相当严重。对于其它地区的羊无浆体病的发病率和死亡率，由于缺乏数据， 所以难以估计其对养羊业造成的直接经济损失，但可以肯定该病的存在对我国 的养羊业潜在着一定的威胁。无浆体的病原体外培养一直存在着较大困难，尽 管近年来边缘无浆体的体外培养取得了一定的进展，但羊无浆体的体外培养至 今尚未见报道。由于缺乏体外培养系统和实验动物模型。传统用姬姆萨染色， 然后显微镜检查，大多数红细胞内的边缘无浆体和羊无浆体位于细胞的边缘， 而中央无浆体则位于中央。尽管不同病原在红细胞内的位置不同能为显微镜检 查提供有力的证据，但这些检测需要专业人员，而且染虫率低时容易发生漏检， 这都成为了传统诊断该病原的障碍。

发明内容

本发明就是要解决现有技术存在的缺陷，将主要表面蛋白4(MSP4)基因引 入到羊无浆体病的诊断技术中，提供一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无 浆体病原的试剂中的用途。

本发明的技术问题通过下述技术方案实现：

一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无浆体病原的试剂中的用途，以羊 无浆体主要表面蛋白4基因为靶基因，设计了3对特异性引物，并按一定比例配 制成特异性引物反应混合物，所使用的引物序列如下：

正向外部上游引物F3：5’-GTGTTGCACACAGATTTGCC-3’

反向外部下游引物B3：5’-AGGCTTTTGCTTCTCCGG-3’

正向内部引物FIP：

5’-GCCCCTGTAGGCTAGCTTTGTGgaattcCCCATATGTGTGTGCCGG-3’

反向内部引物BIP：

5’-TGGTGGTAGGTGGGTTCTACCAgaattcATGTGCGGGTATGTCCTTG-3’

环上游引物LF：5’-TGTCGACAAAGCTAGCACC-3’

环下游引物LB：5’-CGGACTCTTTGACGAGTCTT-3’

所述特异性引物反应混合物包括：终浓度为40pmol的FIP和BIP；终浓度 为20pmol的LF和LB；终浓度为5pmol的F3和B3。

所述检测羊无浆体病原的环介导恒温扩增方法采用下列步骤完成：

a、恒温扩增：羊无浆体病原的环介导恒温扩增即特异性引物反应混合物 1.0uL；2×LAMP反应缓冲液12.5uL；灭菌纯净水9.5uL；基因组DNA-阳性或 空白样品1.0uL；Bst DNA聚合酶1.0uL；共计25uL，在65℃扩增30分钟，80℃ 灭活2分钟；

b、电泳检测：用1×TAE缓冲液配制2％的琼脂糖凝胶，每孔加入3uL上述 LAMP扩增产物和1.5uL的6×上样缓冲液，100伏，75安，电泳80分钟，在 紫外凝胶成像仪下观察结果；

c、按判断标准判断检测羊无浆体病原。

所述扩增反应体系中各组分体积比如下：

特异性引物反应混合物∶2×LAMP反应缓冲液∶灭菌纯净水∶基因组DNA- 阳性或空白样品∶Bst DNA聚合酶＝1∶12.5∶9.5∶1∶1。

在本反应体系所述特异性引物反应混合物的终浓度为40pmol的FIP和BIP、 20pmol的LF和LB和5pmol的F3和B3。