[发明专利]一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无浆体病原的试剂中的用途

权利要求书

1.一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无浆体病原的试剂中的用途，其 特征在于以羊无浆体主要表面蛋白4基因为靶基因，设计了3对特异性引物，并 按一定比例配制成特异性引物反应混合物，所使用的引物序列如下：

正向外部上游引物F3：5’-GTGTTGCACACAGATTTGCC-3’

反向外部下游引物B3：5’-AGGCTTTTGCTTCTCCGG-3’

正向内部引物FIP：

5’-GCCCCTGTAGGCTAGCTTTGTGgaattcCCCATATGTGTGTGCCGG-3’

反向内部引物BIP：

5’-TGGTGGTAGGTGGGTTCTACCAgaattcATGTGCGGGTATGTCCTTG-3’

环上游引物LF：5’-TGTCGACAAAGCTAGCACC-3’

环下游引物LB：5’-CGGACTCTTTGACGAGTCTT-3’

2.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无浆体病 原的试剂中的用途，其特征在于所述特异性引物反应混合物包括：终浓度为40 pmol的FIP和BIP；终浓度为20pmol的LF和LB；终浓度为5pmol的F3和B3。

3.根据权利要求1和2所述的一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无浆 体病原的试剂中的用途，其特征在于采用下列步骤完成：

a、恒温扩增：羊无浆体病原的环介导恒温扩增即特异性引物反应混合物 1.0uL；2×LAMP反应缓冲液12.5uL；灭菌纯净水9.5uL；基因组DNA-阳性或 空白样品1.0uL；Bst DNA聚合酶1.0uL；共计25uL，在65℃扩增30分钟，80℃ 灭活2分钟；

b、电泳检测：用1×TAE缓冲液配制2％的琼脂糖凝胶，每孔加入3uL上述 LAMP扩增产物和1.5uL的6×上样缓冲液，100伏，75安，电泳80分钟，在 紫外凝胶成像仪下观察结果；

c、按判断标准判断检测羊无浆体病原。

4.根据权利要求1所述的一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无浆体病 原的试剂中的用途，其特征在于所述扩增反应体系中各组分体积比如下：

特异性引物反应混合物∶2×LAMP反应缓冲液∶灭菌纯净水∶基因组DNA- 阳性或空白样品∶Bst DNA聚合酶＝1∶12.5∶9.5∶1∶1。

5.根据权利要求3和4所述的一种环介导恒温扩增引物在制备检测羊无 浆体病原的试剂中的用途，其特征在于在本反应体系所述特异性引物反应混合 物的终浓度为40pmol的FIP和BIP、20pmol的LF和LB和5pmol的F3和B3。