[发明专利]用于干扰目标序列的RNAi片段及RNAi表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，特别是涉及一种用于干扰目标序列的RNAi片段及RNAi表达载体，及其制备和构建方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近几年发展起来的高效、特异、易操作的基因沉默新技术，相对于反义及共抑制技术，可获得更高的基因沉默效率。它是真核生物体内由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的降解同源RNA的现象。在细胞中，长的dsRNA被类似RNA酶III的Dicer酶切割成21-26核苷酸(nucleotide，nt)的干扰性小RNA(small interfering RNA或short interfering RNA，siRNA)。随后，siRNA与蛋白复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，并解链。而有活性的RISC在其中的siRNA反应链指导下同与其互补的转录物结合，导致RNA的降解。这是一种转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silence，PTGS)，也称RNA沉默(RNA silencing)(Fire et al，1998；Meister et al，2004)。

RNAi在进化上是高度保守的，是真核生物体内天然的抗外源基因侵入的防御系统。RNAi的最主要的特点在于其作用的高度特异性，这一特点是由siRNA与目的RNA特异性互补所保证的。Semizarov等(2003)针对同一个基因的三个不同靶作用区设计了不同的siRNA序列对靶基因进行沉默诱导，利用DNA芯片(DNA mircoarrays)对RNAi过程中的基因表达特征进行分析以检测siRNA的特异性。结果表明，针对同一作用区的不同siRNA对目的基因施加影响后，目的基因表现出几乎相同的表达特征，可是针对不同作用区的siRNA对目的基因表达的影响各不相同。而Chi等(2003)和Jackson等(2003)通过对特异siRNA干扰后基因组的表达变化进行分析，同样证明了RNAi的高度特异性。其实，也正是因为RNAi具有高度特异性的特点而成为鉴定基因功能(Uhlirova et al，2003；Van et al，2003)，基因组分析(Ashrafi et al，2003；Pothof et al，2003；Kamath et al，2003)，植物抗病毒研究(Kubota et al，2003；Vanitharani et al，2003)，人类多种疾病治疗(McCaffrey et al，2003；Lee et al，2003；Kao et al，2004)研究等的有力工具。

由于利用RNAi技术需要将设计的核苷酸片段导入载体以形成颈环结构的RNAi的表达单位(参见图2)，因此方便有效的RNAi表达载体的构建成为高效利用RNAi技术的关键。

传统的RNAi表达载体构建方法为，根据目的基因高度保守区设计3对引物分别扩增该区段的正、反向片段和loop环序列(即图2中的单链环状区)。利用PCR分别扩增三个片段，再分别酶切连接到相应的载体上，然后测序鉴定阳性克隆。该方法需要多步酶切、连接，操作过程复杂，费时费工。或者采用人工合成整个正反向片段及loop环序列，但是成本很高，且直接酶切的效果差。

发明内容

由于在现有技术中，长度小于60bp的人工合成序列的合成成本(例如0.8元人民币/个碱基)大大低于长度大于60bp的人工合成序列(例如3.8元人民币/个碱基)，因此本发明采取的方法为，分段合成长度小于60bp的序列，每条序列分别磷酸化，退火即得到含有酶切位点粘性末端(或平末端)的RNAi干扰片段。该方法不用反复酶切、连接，简化了实验步骤，而且由于短片段合成成本低，与人工合成整个颈环结构的基因序列相比，大大降低了实验成本。具体地，

本发明的一个方面涉及一种用于干扰目标序列的RNAi片段，其特征在于所述RNAi片段是通过以下方法得到的：

1)针对需要干扰的目标序列，任意设计一段不与目标序列互补的序列S，得到一个理论序列，即5’-目标序列-序列S-目标序列的反向互补序列-3’；