[发明专利]用于干扰目标序列的RNAi片段及RNAi表达载体

权利要求书

1.一种用于干扰目标序列的RNAi片段，其特征在于所述RNAi片段是通过以下方法得到的：

1)针对需要干扰的目标序列，任意设计一段不与目标序列互补的序列S，得到一个理论序列，即5’-目标序列-序列S-目标序列的反向互补序列-3’；

2)将1)中所述理论序列分N段合成，得到一定大小的N段核苷酸序列，所述N段核苷酸序列按照理论序列从5’到3’的顺序分别命名为F1-FN；将所述理论序列的反向互补序列分M段合成，得到一定大小的M段核苷酸序列，所述M段核苷酸序列按照理论序列的反向互补序列从5’到3’的顺序分别命名为R1-RM；同时在F1和R1的5’端分别添加含有限制性内切酶酶切位点粘性末端或平末端的核苷酸序列；其中与F(N-1)末端和FN首端的核苷酸序列互补的序列，存在于同一条对应的M段核苷酸序列之一上；

3)将N段核苷酸序列和M段核苷酸序列的5’-OH分别进行磷酸化；

4)将磷酸化后的N段核苷酸序列和M段核苷酸序列等比例混合，先变性，再退火，得到用于干扰目标序列的RNAi片段；在退火后可任选地加入对退火产物中符合理论序列大小的片段进行纯化的步骤。

2.一种用于干扰目标序列的RNAi片段的制备方法，其包括以下步骤：

1)选定需要干扰的目标序列，任意设计一段不与目标序列互补的序列S，得到一个理论序列，即5’-目标序列-序列S-目标序列的反向互补序列-3’；

2)将1)中所述理论序列分N段合成，得到一定大小的N段核苷酸序列，所述N段核苷酸序列按照理论序列从5’到3’的顺序分别命名为F1-FN；将所述理论序列的反向互补序列分M段合成，得到一定大小的M段核苷酸序列，所述M段核苷酸序列按照理论序列反向互补序列从5’到3’的顺序分别命名为R1-RM；同时在F1和R1的5’端分别添加含有限制性内切酶酶切位点粘性末端或平末端的核苷酸序列；其中与F(N-1)末端和FN首端的核苷酸序列互补的序列，存在于同一条对应的M段核苷酸序列之一上；

3)将N段核苷酸序列和M段核苷酸序列的5’-OH分别进行磷酸化；

4)将磷酸化后的N段核苷酸序列和M段核苷酸序列等比例混合，先变性，再退火，得到用于干扰目标序列的RNAi片段；在退火后可任选地加入对退火产物中符合理论序列大小的片段进行纯化的步骤。

3.权利要求1的RNAi片段或权利要求2的制备方法，其中1)中所述的需要干扰的目标序列长度为10-175bp，优选为30-120bp，更优选为60-80bp。

4.权利要求1的RNAi片段或权利要求2的制备方法，其中1)中所述的序列S的长度为3-30bp，优选为10-25bp，更优选为15bp；序列S中的AT含量为大于50％，优选为60-90％。

5.权利要求1的RNAi片段或权利要求2的制备方法，其中2)中所述的N段核苷酸序列或M段核苷酸序列的大小为小于等于60bp。

6.权利要求1的RNAi片段或权利要求2的制备方法，其中2)中所述的N和M各自独立地选自2、3、4、5和6，优选为2、3和4，更优选为3。

7.权利要求1的RNAi片段或权利要求2的制备方法，其中2)中所述的FN与RM的序列相同。

8.权利要求1的RNAi片段或权利要求2的制备方法，其中4)中所述的变性温度为大于等于90℃，优选为92-98℃，更优选为94-96℃。

9.一种重组载体，其特征在于包含权利要求1所述的RNAi片段。

10.权利要求9的重组载体的构建方法，其包括以下步骤：

1)将载体用权利要求1步骤2)中所述的限制性内切酶进行酶切，与权利要求1的用于干扰目标序列的RNAi片段连接，即得到重组载体。

2)任选地，对1)中得到的重组载体中干扰片段的插入进行验证。

11.权利要求1所述的RNAi片段或权利要求2的制备方法用于构建RNAi表达载体的用途。